脑出血患者血肿周围组织补体激活与炎性反应的相关性研究

脑出血患者血肿周围组织补体激活与炎性反应的相关性研究作者：郭富强,李晓佳,陈隆益,杨友松,杨红,代红源,韦永胜,黄雨兰,孙红斌,徐玉川,杨正林    作者单位：610072成都，四川省人民医院神经内科（郭富强,李晓佳,杨友松，代红源，韦永胜,黄雨兰,孙红斌），神经外科（陈隆益），病理科（杨红，徐玉川），人类遗传疾病与基因研究中心（杨正林，现在美国犹他大学分子生物学与遗传研究中心）    【摘要】  目的 研究脑出血患者血肿周围组织补体激活与炎性反应的关系。 方法 对30例脑出血患者（实验组）在手术时于血肿旁约1 cm处取少许脑组织，按发病到手术的时间将实验组分为<6 h组(6例)，6~12 h组(7例)，12~24 h组(5例)，24~72 h组(6例)，>72 h组(6例)。从前2组中选7例患者(对照组)在手术入颅路径上远离血肿处取少许脑组织。应用免疫组化染色，逆转录聚合酶链反应（RTPCR）分别观察补体C3和补体抑制剂（Clusterin）的表达与炎性细胞的浸润、胶质细胞增生、炎性细胞因子的表达情况。结果 与对照组相比，脑出血患者C3表达高峰在12~72 h（P<005~001），Clusterin表达于12~72 h有增高趋势，但无统计学意义；炎性细胞浸润从6~12 h逐渐明显，12~72 h达高峰（P<005~001）；小胶质细胞、星形胶质细胞于24~72 h后增生明显（均P<001）；肿瘤坏死因子α（TNFα）表达于12~72 h达高峰（P<005~001），后逐渐降低。RTPCR显示：TNFα mRNA的表达与蛋白表达基本一致；白细胞介素（IL）1β(IL1β)和IL6 mRNA表达于12~72 h达峰值（均P<001）。相关因素分析显示：C3表达与炎性细胞浸润和胶质细胞增生及与细胞因子表达呈显著正相关（r=0.42~080;P<005~001），而Clusterin与上述表达无相关性。结论 脑出血患者血肿周围组织补体激活与炎性反应有密切关系。    【关键词】  脑出血；血肿周围组织；补体；炎性反应　　Study on the relationship between complement activation and inflammatory reaction in tissues of the perihematoma in patients with intracerebral hemorrhage GUO Fuqiang, LI Xiaojia, CHEN Longyi,et al.Department of Neurology,Sichuan Province Peoples Hospital, Chendu 610072,  China　　Abstract：Objective  To study the relationship between complement activation and inflammatory reaction in tissues of the perihematoma in  patients with intracerebral hemorrhage (ICH).Methods  A few tissues near 1cm area around the hematoma in 30 patients (research group) were cut and divided into 5 groups according to the time after ICH, 6,7,5,6,6 patients in 6 h,6~12 h,12~24 h,24~72 h,>72 h goups, respectively. A few tissues distant from the hematoma on the way into the cranium were taken from the 2 former groups as control. Immunohistochemistry staining and  reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR)  were used to detected expression of  complement facters C3 ,complement inhibitor (Clusterin),the infiltration of the inflammatory cells, the proliferation of neuroglia cells and the expression of cytokins.Results  The immunohistochemistry staining showed that the expression of complement facter C3 got to the peak at 12~72 h (P<005~001) after ICH,the expression of Clusterin began to increase at 12~72 h after ICH,but there was no statistically significant between the two groups ,the infiltration of  the inflammatory cells began at 6~12 h and reached the maximum at 12~72 h (P<005~001).The microglias，satellite cells quantified markedly after 24~72  h(P<001) and the expression of tumor necrosis facteralpha (INFα) got to the maxium at 12~72 h (P<005~001),decreased later. RTPCR indicated that TNfαmRNA expression  were coincident with the protein changes ,the interleukins1β( IL1β)，IL6 mRNA got to the maximum at 12~72 h（all P<001）.The relation analysis indicated that the expression of complemen facter C3 was strongly positively correlative to infiltration of inflammatory cells, the proliferation of neuoglia cells and the expression of cytokins(γ=042~080,P<005~001).Clusterin was no dependablity to what had mentioned above.Conclusion  There is a close relationship between the complement activation and the inflammatory reaction in the tissues of perihematoma in patients with ICH.　　Key words：intracerebral hemorrhage ；perihematoma；complement；inflammatory reaction　　近年来的动物实验和临床研究［1~5］表明，脑出血后在血肿周围组织中存在一系列继发性病理生理损伤的变化，包括病理性缺血性改变、炎性损伤反应、凝血酶的毒性作用、补体激活、氧自由基反应及脑水肿等。目前这方面的报道不多，为此，本研究就脑出血患者血肿周围组织补体C3、补体抑制剂（Clusterin）与炎性反应及其细胞因子的表达变化等进行了相关研究，现报告如下。1  对象与方法　　1.1  对象  （1）实验组：30例，均系我院2003年1月~2005年1月住院拟手术的脑出血患者。男21例，女9例；年龄23~76岁，平均（55.3±125）岁。血肿大小为 40~70 ml，小脑出血>10 ml。按发病到手术取标本的时间分为：发病<6 h组6例，6~12 h组7例，12~24 h组5例，24~72 h组6例，>72 h组6例。基底节出血25例，脑叶出血3例，小脑出血2例。(2)对照组：7例，为实验组中发病<12 h的脑出血患者，其中基底节区出血5例，脑叶出血1例，小脑出血1例。　　1.2  方法　　1.2.1  标本的采集  术前经患者家属签署知情同意书后采集标本。手术均采用非功能区入颅,于血肿旁1 cm左右（在清除血肿前）取少许脑组织作为血肿周围组织组(实验组)。并于入颅路径上远离血肿处取少许脑组织作为对照组。病理组化观察组织置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定待查；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）观察组织置于无菌盒中，迅速放于-70℃冰箱中待查。　　1.2.2  免疫组化染色方法  采用LDP法，操纵步骤按所购试剂盒说明书进行。CD45、CD68（CD人类白细胞共同抗原）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（三者分别标记中性粒细胞、巨噬细胞、胶质细胞）、补体C3、Clusterin、肿瘤坏死因子（TNFα）结果阳性的表达为细胞质或胞核出现棕黄色反应即为阳性。显微镜下测量10个独立高倍视野（×400）中神经细胞及胶质细胞C3、Clusterin 、CD45、CD68、GFAP、TNFα表达阳性的细胞数，然后将10个不重复视野的细胞数相加再除以10得出该例阳性细胞表达数。　　1.2.3  RTPCR  （1）RTPCR引物的合成：从NCBI中查找相应的mRNA序列，采用软件Primer 5设计引物，由TakarRa公司合成。各引物PCR产物片断大小及序列如下：βactin（184 bp）上游5′caactccatcatgaagtgtgac3′,下游5′ccacacggagtacttgcgctc3′;TNFa (176 bp) 上游5′ttcctcagcctcttctcctt3′,下游5′gctacaggcttgtcactcgg3′；白细胞介素1β(IL1β) (391 bp) 上游5′aaacagatgaagtgctccttccagg3′,下游5′tggaagaacaccacttgttgctcca3′；IL6(113 bp)上游5′agtgaggaacaagccagagc3′,下游5′gcatttgtggttgggtcag3′。（2）组织中总RNA提取和TwoStep RTPCR方法按Trizol说明书进行。（3）Twostep RTPCR检测 mRNA的表达：①逆转录：按TakaRa RNA PCR Kit(Amv)Ver 3.0说明书进行，将总RNA逆转录为cDNA;②扩增：反应体系为50 μl，程序如下：94℃5 min 预处理，94℃30 s变性；βactin 58 ℃，TNF 60℃,IL1β 58℃,IL6 60℃均45 s退火；72℃ 55 s延伸；72℃ 7 min末次延伸；βactin循环28次，TNF循环32次，IL1β循环36次，IL6循环30次。取扩增产物5 μl，加入5 μl Loading Buffer 后上样于15%琼脂糖凝胶电泳。　　1.2.4  统计学方法  采用SPSS 102软件进行统计分析。所测数据以均数±标准差(±s)表示，用单因素方差分析、组间分析以及直线相关分析的方法对相应数据进行统计学处理，相关系数用pearson相关系数表示。2  结果　　2.1  脑出血患者血肿周围组织C3、Clusterin与炎性反应的动态观察  见表1、表2，图1A~L。(1)C3、Clusterin动态表达情况：脑出血6 h后血肿周围组织C3阳性细胞表达逐渐增加，至12~72 h，阳性细胞表达增加达高峰（P<005~001），72 h后有逐渐下降趋势；Clusterin表达于12~72 h有逐渐上升趋势，但无统计学意义。(2)炎性细胞和胶质细胞增生情况：对照组基本上未见中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润；脑出血后6 h内可见少许中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润，小胶质细胞和星形胶质细胞增生不明显；到12~24 h中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润达高峰（P<005~001），小胶质细胞和星形胶质细胞明显增生，以后炎性浸润逐渐减轻；到24~72 h后胶质细胞增生达高峰（均P<001）。(3)炎性细胞因子表达：对照组基本无TNFα蛋白和mRNA表达，也未见IL1β和IL6 mRNA表达；脑出血6 h后见少量TNFα蛋白和 mRNA，IL1β和IL6 mRNA的表达；至12~72 h达高峰（P<005~001）；72 h后逐渐下降。　　2.2  脑出血患者血肿周围组织C3、Clusterin表达与炎性反应的相关分析  见表3。(1) C3表达与中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润和小胶质细胞、星形细胞增生数量，与TNFα蛋白和mRNA，与IL1β和IL6 mRNA表达呈显著正相关（r=0.42、r=0.55、r=0.63、r=0.70、r=0.73、r=0.76、r=0.76、r=077、r=0.80；P<005~001）。(2)Clusterin表达与中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润和小胶质细胞、星形细胞增生数量，与TNFα蛋白和mRNA，与ILβ1和IL6 mRNA表达无显著相关性。　　表1  实验组与对照组脑出血不同病程炎性细胞和胶质细胞反应与补体表达的比较（略）　　注：与对照组比较△P<005,*P<001　　表2  炎性细胞因子与补体在脑出血不同病程表达的比较（略）　　注：与对照组比较△Ｐ<0.05,*Ｐ<0.01　　表3  脑出血患者血肿周围组织C3、Clusterin表达与炎性反应关系（略）　　注：△P<005,*P<001　　图1  脑出血患者血肿周围组织CD45、CD68、GFAP 、C3、Clusterin在不同时间组织化学染色变化（略）　　A:对照组见少许中性粒细胞表达（× 400）；B：12~24 h 组中性粒细胞表达明显（× 400）；C：对照组见少许淋巴红细胞表达（× 200）；D：12~24 h组淋巴细胞表达明显（× 200）；E：对照组；F：为GFAP组化染色（×200），对照组基本未见星形胶质细胞表达，24~72 h星形胶质细胞表达明显；G：对照组见少许TNFα表达（× 200）；H：12~24 h组TNFα表达明显（× 200）；I：对照组见少许C3表达（× 200）；J：24~72 h组C3表达明显；K：对照组；L：24~72 h组，L组与K组表达无明显差异3  讨论　　补体作为免疫反应的参与者，广泛存在于人的血清和组织中，参与机体的防御和免疫调节作用，不当剌激可介导免疫损伤反应［5］。脑内补体的来源主要有两方面；一方面由脑内的星形细胞、小胶质细胞，神经元可合成补体，星形细胞又可合成TNFα、IL1β、IL6，并在适当的剌激下，合成有功能的补体；另一方面，在血脑屏障破坏时，血循环中的补体，可大量向脑内渗漏，同时浸润至脑内的中性粒细胞、巨噬细胞，并有合成分泌补体的功能［6］。正常情况下，脑内补体系统与补体抑制处于动态平衡，故不发生病理损伤反应［5］。脑出血后，由于血脑屏障的破坏，血浆和中枢神经系统抗原物髓鞘、磷脂、凝血酶、血红蛋白均能激活脑内补体，使补体C3等形成催化作用的C3a等，引起免疫级链反应，导致继发性脑损伤。此外，由于脑出血后,通过破坏的血脑屏障，浸润血肿周围组织炎性细胞本身也具有合成及分泌补体的功能，进一步加重脑损害。激活的补体C3能促进肥大细胞、嗜碱性细胞释放炎症介质组织胺，破坏血脑屏障，还具有趋化因子作用，使大脑白细胞聚集，释放溶酶体，破坏细胞的结构和功能［7］。C3还可引起巨噬细胞释放TNFα、IL1β、IL6等细胞因子，进一步加剧脑组织的病理损伤反应［8］。 　　Hua等［9］在大鼠脑出血的实验中发现，血肿周围组织补体C3、C9及激活后的过敏毒素C3a明显增加，同时补体抑制剂Clusterin也相应增加，但增加的幅度低于C3、C9，使补体激活系统与抑制系统平衡破坏，导致免疫损伤。认为激活脑内补体系统是引起脑出血后继发性脑损伤的主要原因。张丽等［6］也在大鼠脑出血的实验研究中证实，脑出血后6 h，补体C3表达增加，72 h达高峰，同时血肿周围组织24 h有少量炎性细胞浸润，48 h达高峰（P<005~001），以后逐渐减轻，认为补体激活与炎性细胞的浸润、与脑出血后脑水肿的形成及继发性脑损伤有关。van Beek等［7］在大鼠脑出血的实验中发现，激活的补体C3a、C5a能剌激炎性细胞合成TNFα，激活细胞产生IL1β、IL6等细胞因子，引起脑的免疫损伤。本研究通过对脑出血患者血肿周围组织的补体C3、Clusterin和炎性反应及细胞因子表达的动态观察发现，脑出血后6 h内C3表达轻度增高，以后逐渐增高；24~72 h达高峰，以后逐渐减轻。同时，对照组有Clusterin的轻微表达，略高于C3表达；到24~72 h表达有增加趋势，但无统计学差异。炎性细胞浸润在6 h内轻微增加，以后逐渐增高，12~24 h达高峰（P<005~001），以后逐渐减轻。星形胶质细胞、小胶质细胞的增生在6 h内与对照组相似；6~12 h增生逐渐明显，至24~72 h达峰值（均P<001）；72 h以后仍较高。而细胞因子TNFα蛋白和mRNA、IL1β和IL6 mRNA的表达，在对照组与脑出血6 h内相似，表达轻微，6~12 h表达逐渐增加，24~72 h达高峰（均P<005~001），72 h后逐渐减轻。相关分析显示：补体C3的表达与中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的浸润和星形胶质细胞、小胶质细胞的增生及TNFα蛋白和mRNA、IL1β、IL6 mRNA表达呈显著正相关（r=0.42~080,P<005~001）；Clusterin的表达与上述诸项无相关性(均P>005)。上述结果提示：脑出血后随着病程的进展，免疫损伤反应逐渐加剧，在24~72 h这种继发性的损伤最明显，与病理损伤的结果一致，也与多数脑出血的临床病情程度相吻合。但与 Hua的动物实验所不同的是， Clusterin的表达并未随C3表达的增高而明显增高，这更加剧了补体与补体抑制剂的不平衡，导致免疫损伤加剧，恰好与病理损伤和临床病情程度相一致。这种不一致的原因是否正是动物实验与人脑出血后的病理生理不完全一致尚不清楚，推测是否为脑出血患者的干扰因素较多有关，加之脑出血后引起免疫反应的原因较复杂，也许有些因素在脑出血后可能抑制了Clusterin的表达，从而引至免疫损伤加剧。有关这方面的推论还有待今后进一步研究证明。 　　综上所述，可见脑出血后在血肿周围组织中存在的继发性病理损伤与补体介导的免疫反应和炎性细胞浸润及细胞因子表达有关。在脑出血后如能及早阻止补体的激活、促进补体抑制剂的表达、抑制炎性细胞的浸润和胶质细胞增生，也许可大大减轻血肿周围的继发性损伤，从而减轻患者的病情，降低死亡率和致残率。【参考文献】　　［1］Xue M,del Bigic MR.Intracortical hemorrhage injury in rats:relationship between blood fractions and 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