依达拉奉改善大鼠血脑屏障损伤的AQP4机制研究

　　作者：张衍 王焕成 宋明爱    作者单位：河南南阳市第一人民医院 南阳 473000 　　【摘要】  目的 研究大鼠脑出血后血脑屏障(BBB)通透性与水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)的关系及依达拉奉的干预作用。方法 采用自体动脉血注入尾状核法制成大鼠脑出血模型，免疫组化法观察AQP4的表达，伊文思蓝法测BBB的通透性，干湿重法计算脑含水量表示脑水肿。结果 与对照组相比，模型组及依达拉奉组BBB通透性均在出血后6h开始升高，1～3d最高，依达拉奉组明显小于模型组(P<0.01)。2组AQP4也于6h开始升高，1～3d达到高峰依达拉奉组明显小于模型组(P<0.05)。BBB通透性与AQP4表达呈显著正相关(r = 0.880,P<0.01),与脑水肿变化趋势一致。结论 脑出血后产生的AQP4增多,从而增加BBB通透性,参与脑水肿形成和发展，依达拉奉可抑制AQP4的表达，从而有减轻脑水肿的作用。

　　【关键词】  脑出血;脑水肿;血脑屏障;AQP4;依达拉奉

　　Research on acting mechanism of edavarone on AQP4 in rats with blood brain barrier injury after acute cerebral hemorrhage Zhang Yan, Wang Huancheng, Song Mingai. Department of Neurosurgery, the First People’s Hospital, Nanyang 473000, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the relationship between bloodbrain spinal fluid barrier (BBB) permeability and aquaporin4 (AQP4)and the effect of edavarone after experimental intracerebral hemorrhage (ICH) in rats.Methods The ICH model were established by stereotaxic injection of autologous artery blood into caudate nucleus to detect AQP4 expression by immunohistochemical method, BBB permeability by EB method and brain water contents by dry wet weight method. Results In contrast to the controlled group, BBB permeability increased at 6 hours in ICH group and edavarone group after ICH, reached peak at 1～3 days, and which in edavarone group was lower than that in ICH group (P<0.05). Edavarone expression increased at 6 hours in two groups reached peak at 3 days , and which in edavarone group was lower than that in ICH group (P<0.05). There was a significantly positive correlation between AQP4 expression and BBB permeability (r = 0.880, P <0.01).Conclusion After ICH AQP4 expression up regulate and BBB permeability increase, which could be inhibited by edavarone

　　【Key words】 Cerebral hemorrhage; Cerebral edema; AQP4; Bloodbrain spinal fluid barrier; Edavarone

　　脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)脑水肿是影响患者病情程度及预后的重要因素,而后期血脑屏障损伤引起的血管源性脑水肿是主要的原因。由于伊文斯蓝具有不能透过血脑屏障的特性, 本实验以检测脑组织中伊文斯蓝(EB)含量来分析脑出血后血脑屏障和AQP4的关系，进一步探讨依达拉奉改善脑出血大鼠血脑屏障损伤的AQP4机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 成年SD雄性大鼠90只，由新乡医学院动物实验中心提供，体质量280～300g。标准饲料喂养和自由饮水，保持室温20～25℃及恒定的湿度。按数字表随机分为对照组、模型组、依达拉奉组各30只。每组在随机分为术后6h、1d、3d、5d、7d 5个时相点，每个时相点下6只。

　　1.2 实验方法 (1)模型组：以4%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉。参考Hua等[1]方法固定大鼠。头正中切约lcm的纵切口，暴露前囟，使微量注射仪套管尖端移至前囟前 0.5mm，左侧中线旁3mm，用大针头钻孔,穿透颅骨。用 40℃水温浴鼠尾约10min取出擦干，在距鼠尾末端约5mm处剪断，用微量注射仪吸新鲜血液约50μl，迅速插入钻好的孔内，向内进针6mm。在 2.5min内注入，留针5min后缓慢退针。拔针后无血液自针道返流，苏醒后出现神经功能缺损症状视为造模成功。(2)对照组：前期操作同模型组，但不注血液。(3)依达拉奉组：建模前每隔12h腹腔注射依达拉奉2mg/kg直到相应的时相点,对照组及模型组用等量的生理盐水腹腔注射。

　　1.3 检测方法

　　1.3.1 干鲜质量的测定: 取血肿中心前半分区脑组织,准确称重置于100～110℃的烤箱中烘烤24 h至恒重后,称取干质量，根据公式：脑组织含水量(%) = (鲜质量-干质量) /鲜质量来计算,精确度为0.1。

　　1.3.2 血脑屏障通透性测定：采用伊文思蓝甲酰胺法，大鼠处死前1 h 经尾静脉注入2% EB (2ml/kg) ,称取血肿内侧部分置于甲酰胺(1ml/100g脑组织)中60℃孵育24h。1000 r/ min ,离心5min,分光光度计(λ= 632nm) 测定上清液OD 值,根据标准曲线计算出EB含量。

　　1.3.3 AQP4免疫组化检测：常规脱水,加一抗AQP4(1∶50),加生物素标记山羊抗兔IgG,脱片,显微镜下观察。棕黄色为强阳性,黄色为阳性,浅黄色为弱阳性,与间质颜色一致者为阴性。随机采集5个高倍视野(10×40)，采用双盲法计算每个高倍镜视野AQP4阳性细胞表达率。

　　1.4 统计学分析 实验数据计量资料均以±s表示，应用 SPSS 13.0统计软件包对数据进行处理。多组间比较采用单因素方差分析检验，变量之间做两两的直线相关分析，P<0.05差异有统计学意义。

　　2 结果

　　见表1、2、3、4。表1 脑出血后不同时间点脑含水量注：与假手术组比较，*P<0.05;与ICH组同一时间点比较，#P<0.05表2 脑出血后不同时间点脑组织EB含量 表3 脑出血后不同时间点脑组织AQP4表达含量 表4 EB含量与AQP4表达的相关分析注：相关性检验，*P<0.01 ;表格数值为相关系数r值

　　3 讨论

　　AQP4是近年来研究比较多的一类水特异性膜内在蛋白，为水分子跨膜转运提供了一个全新的分子结构基础，对于维持机体的水平衡起着重要作用，并且与水平衡紊乱所造成的一些疾病有密切关系[2]。AQP4广泛存在于中枢神经系统的星形胶质细胞膜、蛛网膜下腔、血管周围的胶质细胞、室管膜细胞、脉络丛及下丘脑渗透压感受区器官，并认为其在中枢神经系统作为渗透压感受器有介导和调节水的运输和平衡的作用。在生理条件，水通道基本上是处于激活状态，水转运过程很快，一般不需门控和其他调节，而在脑出血后6 h，水肿区的阳性细胞数增多，阳性细胞体积增大，AQP4表达增强，第3天达高峰，此后逐渐回落，但1周后仍明显高于正常。 已有研究表明，AQP4不仅参与脑组织水代谢的生理和病理过程，而且可能与调节脑脊液的形成及细胞外液容积的变化有关，参与脑水肿的多种生理、病理过程发生脑水肿时AQP4表达增加，是星形胶质细胞适应细胞外环境变化的反应，同时AQP4又促进了星形胶质细胞水肿的发生和发展，而AQP4表达的下调或缺陷对减轻脑水肿程度、降低病死率和致残率有重要作用。这显示AQP4在脑组织水的运输中起关键性作用，且提示调节AQP4变化可能为减轻各种脑疾病所致脑水肿提供新的治疗方法。

　　脑出血后脑水肿主要是血脑屏障受损，通透性增加，血浆渗出引起的血管源性脑水肿。本实验显示脑出血后血浆中AQP4的浓度出现了明显的增高，随着AQP4含量的增高，脑水肿也随之明显加重,到72h达高峰。表明AQP4的大量产生与脑水肿发生之间有一定的关系。本实验结果还显示，脑出血后AQP4的浓度从6h逐渐增高,脑水肿的变化趋势与之大致相同, 5d达峰值,7d开始下降。脑出血组脑组织EB含量在脑出血后6h上升, 1～3d达到高峰后缓慢下降,1d与3d相比无显著性差异( P>0.05),推测BBB通透性的高峰出现在1～3d。BBB通透性与AQP4表达的相关分析显示二者呈显著正相关,表明脑出血后AQP4表达的上调可能引起BBB的开放,使BBB通透性增加。脑含水量在脑出血后6h也开始升高,3d达到高峰,之后开始下降,7d仍然高于正常,与AQP4表达的变化一致,二者呈显著正相关，与文献报道一致。脑出血后AQP4表达水平和脑含水量在相应时间点上均高于对照组,提示AQP4表达的上调导致脑含水量的增加,说明AQP4与脑出血后脑水肿的形成有密切关系。本实验中依达拉奉组与出血组相比,BBB通透性高峰出现的时间趋于一致,但峰值明显降低,其他时间点脑组织内EB含量也低于脑出血组,表明依达拉奉能显著降低BBB的通透性，依达拉奉组AQP4表达及脑含水量在各时间点均低于脑出血组,说明应用依达拉奉能够降低脑出血后脑内AQP4的表达及脑含水量。

　　自由基清除剂依达拉奉是目前临床试验证明惟一有效的自由基清除剂[3]，具有自由基清除和抑制脂质过氧化的作用，可以抑制脑细胞 (血管内皮细胞和神经细胞)的过氧化作用，静脉给药后可清除脑内的具有高度细胞毒性的羟基基团。体内试验显示[4]，依达拉奉还能抑制血管内皮细胞损害，抑制脑水肿、改善神经功能。

【参考文献】　　[1] Hua Y, Schallert T, Keep RF, et al. Behavioral test after intracerebral hemorrhage in the rat [J]. Stroke, 2002, 33(10): 2 4782 484.

　　[2] Kiening KL, Frank KH,Landeghem V,et al. Decreased hemispheric aquaporin4 is linked to evolving brain edema following controlled cortical impact injury in rats [J].Neuroscience Letters, 2002, 324(2):105108.

　　[3] 渡边俊明，幸敏志，齐藤健一，等 .新规脑保护药 MCI186药理学的检讨[J].药理与治疗，1997，25(suppl7):S181S188.

　　[4] 陈勇，高朴，常娜，等.依达拉奉治疗脑出血的临床疗效观察[J].中国实用神经疾病杂志，2008，11(6)：104105.