兔胸部高速撞击伤后中性粒细胞凋亡与环氧合酶2的关系

    作者：张金洲 ，刘维永 ，易定华 ，王 文    （第四军医大学西京医院心脏外科，陕西 西安 710032） 

   摘要: 目的   观察家兔高速胸部撞击伤后肺内环氧合酶（COX）表达与中性粒细胞凋亡之间的关系。    方法   应用家兔胸部高速撞击伤动物模型，检测伤后支气管肺泡灌洗液中性粒细胞凋亡、肺组织环氧合酶  表达及支气管肺泡灌洗液中前列腺素E    2    浓度。观察肺干湿重比值、肺通透指数及肺组织HE染色。  结果     胸部高速撞击伤后支气管肺泡灌洗液中性粒细胞凋亡比例随时间延长逐渐降低（82.3±12.6与62.5±9.5，   P <   0.05） ，与肺通透指数、肺干湿重比值分别相关（r=-0.79或r=0.91）。伤后肺组织环氧合酶表达显著  升高（   5.8 ±1.2与95.7±12.4， P <0.001），支气管肺泡灌洗液中前列腺素E 2    浓度明显高于伤前（2.6±1.7  与8.9±   3.1 ， P <0.01），PMN凋亡与肺组织COX-2蛋白活性相关系数r=-0.64。  结论   家兔高速胸部撞  击伤后肺内中性粒细胞凋亡抑制和环氧合酶活性增加存在一定的相关性，参与了伤后肺损伤加重的过程。   

    关键词:  胸部损伤; 撞击伤; 中性粒细胞; 细胞凋亡; 环氧合酶   

    Relationship between apoptosis of polymorphonuclear and expression of COX-2 following   chest-impact injuries in rabbits    ZHANG Jin-zhou，LIU Wei-yong，YI Ding-hua，et al.   （Department of Cardiac Surgery，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China）

    Abstract: Objective  To study the correlation between the expression of COX-2 and the apoptosis of PMN fol-  lowing chest-impact injuries in rabbits. Methods  The apoptosis of PMN in BALF，the expression of COX-2 in lung，  the concentration of PGE    2    in bronchoalveolar lavage fluid（BALF），the ratio of dry/wet lung weight and the index of   pulmonary permeability were evaluated in animal model of rabbits stroked by high velocity impactor. Histological ob-  servation of lungs was also conducted. Results  The rate of apoptotic PMN gradually decreased as time prolonged af-  ter injury（82.3±12.6 vs 62.5±9.5， P <0.05），this changes was in correlation with pulmonary permeability and the   ratio of dry/wet lung weight（r=-0.79 or r=0.91）. The expression of COX-2 in lung soared after injury（5.8±1.2   vs 95.7±12.4， P <0.001），and the concentration of PGE    2    in BALF were much higher than that of pre-injury（2.6±  1.7 vs 8.9±3.1， P <0.01）. Correlation existed between the apoptosis of PMN and the expression of COX-2（r=-0.  64）. Conclusion  There is a correlation between the depression of PMN's apoptosis and the expression of COX-2 in   lung after high-velocity impact injury，which might involve in the development of lung injury after injury. 

    Key words: chest injury; impacted injury; polymorphonuclear; apoptosis; cyclooxygenase 

    研究表明中性粒细胞（polymorphnuclear，PMN）  凋亡抑制在急性肺损伤（acute lung injury，ALI）/急  性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syn-  drome，ARDS）的形成中发挥重要作用    ［1］    。而PMN  在脂多糖、白介素和肿瘤坏死因子刺激下环氧合酶  2（cyclooxygenase，COX-2）mRNA表达也增加    ［2］    。有  关ALI/ARDS时COX-2表达增强是否参与PMN凋  亡抑制尚未有报道。本研究观察胸部高速撞击伤后  PMN凋亡抑制与COX-2蛋白表达之间的关系，以对  ALI/ARDS发病机制作进一步探讨。    

    材料与方法   

    1  致伤方法  

    家兔体重（2.35±0.26）kg，雌雄不拘，分为对照  组（5只）和实验组。致伤前从耳缘静脉注射1%戊  巴比妥钠1mg/kg麻醉，固定于撞击台，以右侧胸壁  第4或5肋间与腋中线交界处为撞击点，呼气末准  静态撞击。压缩幅度20%，撞击质量5.7kg，撞击面  积3.14cm    2    ，弹丸速度（20.29±0.03）m/s。对照组  不作胸部撞击伤处理，其余同实验组。 实验组分别  于伤后4、12、24、48、72小时，5个时间点各选取5只  符合ARDS诊断者进入下一步实验。   2  PMN的分离与凋亡检测   实验组分别在各时相点处死动物，取肺组织，用0.9%生理盐水10ml灌洗3次。4℃ 200g离心5分  钟，沉淀加入等体积淋巴细胞分离液，1000r/min离  心10分钟，弃上清，加入红细胞裂解液充分混合后，  800r/min离心5分钟，沉淀中加入DMEM培养基  （10%小牛血清）。台盼兰染色活性>90%，瑞氏姬  母萨染色纯度>90%。将PMN悬浮于10ml离心  管，500～1000r/min离心5分钟，弃去培养液。用孵  育缓冲液洗1次， 500～1000r/min离心5分钟，孵  育缓冲液洗1次。分别加入Annexin V-FITC及PI，  避光4℃孵育20分钟，流式细胞仪检测，Annexin V-  FITC阳性为凋亡细胞，双阳性者为坏死细胞。   3  前列腺素E    2    （PGE    2    ）检测   应用放射免疫法。用    3    H 标记的PGE   

    2    测量试剂 

    盒（购自301医院）检测。   4  COX-2活性检测   应用链霉素蛋白-过氧化物酶连接法，未灌洗肺  组织包埋块，加羊抗兔COX-2单克隆抗体（我校神  经生物研究所提供），4°C过夜; 再加生物素标记兔  抗山羊IgG（二抗），37°C温育0.5小时，DAB显色5  分钟。阴性对照组一抗用0.01mol/L PBS代替。染  色后光镜下作定性观察，用图像分析系统作定量分  析，在每帧图像上随机取10个细胞的积分光密度值  代表免疫反应强度。   5  肺通透指数测定   分别应用考马氏亮兰法、比色法测定支气管肺  泡灌洗液中总蛋白和白蛋白。在每时相点处死的动  物中留取未灌洗的肺，取小块肺组织进行常规HE  染色。用滤纸吸干组织表面后称重，放入50℃烤箱  48小时至恒重，取出后称重，计算肺组织干湿重比。   6  实验结果以 ˉ x±s 表达，采用SPSS10.0统计软件  配对 t 检验，相关分析采用Bivariate进行处理。    结 果    1  PMN凋亡变化（见表1）   凋亡细胞比例在伤后各时相点均明显低于正常  对照组（ P <0.05）。死亡细胞比例在伤后4、12、24、  48小时明显高于对照组（ P <0.01，0.05），而伤后  72小时与正常对照组相比无明显差别。存活细胞  比例在伤后除4小时外，其余各时相点均显著高于  正常组（ P <0.01）。   2  肺通透指数和肺干湿重比   肺通透指数在伤后12小时开始至72小时分别  为1.1±0.3、1.4±0.2、1.5±0.4、1.7±0.6较对照  组0.6±0.2明显升高（ P <0.01），伤后各时间点肺  干湿重比值分别为0.32±0.10、0.29±0.03、0.26±  0.05、0.25±0.01、0.21±0.03较正常对照组0.48   ±0.07均明显降低（ P<0.05，P <0.01）。   3  前列腺素E    2    （PGE    2    ）浓度变化（ng/ml）   PGE    2    浓度在伤后4小时升高为5.09±1.02，与  正常对照组2.6±1.7相比有显著差异（ P <0.05），  12小时达到最高值8.9±3.1（ P <0.01），24小时下  降为5.4±1.4（ P <0.05），至伤后72小时PGE    2    值  为4.8±1.3，与对照组比较无统计学意义。   4  COX-2活性  肺组织COX-2蛋白活性在伤后4小时迅速升高  为95.7±12.4（图1），与对照组（图2）5.8±1.2相  比差别极为显著（ P <0.001）。伤后12小时为49.5  ±5.5，较4小时明显下降（ P <0.01），仍明显高于  对照组（ P <0.01），随后24、48、72小时分别为37.6  ±   6.2 、35.4±5.7、23.1±3.5，呈逐步下降趋势，但  仍高于对照组（ P <0.05，图3）。   

    表1   伤后支气管肺泡灌洗液中性粒细胞凋亡改变（略）

    5  病理观察  

    对照组: 肺泡腔清晰，结构完整，肺泡隔均匀一  致，壁光滑，肺泡腔内无渗出或白细胞。伤后4小时  组: 部分肺泡隔增厚，可见较多炎细胞渗出，局部肺  泡隔断裂、肺泡融合。伤后12小时组: 肺泡隔明显  增厚，断裂、融合数量增多，大量白细胞渗出、聚集，  肺泡腔内可见渗出液和渗出聚集的红细胞。伤后  24小时组: 肺泡间质肿胀，肺泡隔增厚，炎性细胞渗  出聚集，毛细血管扩张充血。伤后48小时组: 肺间  质明显肿胀，毛细血管淤血扩张，炎细胞渗出聚集，  肺泡腔萎陷增多，形成局灶性不张。伤后72小时  组: 肺泡水肿严重，肺泡壁增厚明显，肺泡壁破坏，  伴大量急慢性炎细胞浸润。   6  相关性分析   应用SPSS10.0统计软件进行Bivariate相关分  析后发现，支气管肺泡灌洗液中PMN凋亡比例与肺  通透指数呈负相关（γ=-0.79），与肺干湿重比值  呈正相关（γ= 0.91）; PMN凋亡比例与肺组织  COX-2蛋白相关系数γ=-0.64。   

    讨 论  

    本研究发现胸部高速撞击伤后，家兔支气管肺  泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中凋亡  PMN细胞比例在伤后12小时明显下降，并以较低  水平维持至伤后72小时。死亡细胞比例在伤后4  小时最高，随后逐步下降，而存活细胞比例伤后则持  续上升。后者主要与细胞凋亡受到抑制和死亡细胞  一度上升后随即下降有关，使更多激活状态PMN不  能被及时清除，聚集肺内，分泌更多的蛋白水解酶和  弹性蛋白酶对周围肺组织产生过度损伤作用。肺通  透指数逐渐升高和肺干湿重比值逐渐降低也提示伤  后肺组织损伤随时间延长而逐步加重。并发现肺通  透指数、肺干湿重比值与伤后PMN凋亡比例明显相   关（γ=-0.79和0.91）。说明胸部撞击伤后肺内  PMN凋亡抑制参与了伤后ALI/ARDS的发病过  程    ［1，3］    。   细胞凋亡是细胞主动发生的自然死亡过程，是  平衡细胞增殖，调节机体细胞数量衡定的一种方式。  COX-2与炎症、肿瘤的发生发展有密切关系，是因为  COX-2可以调控一些凋亡相关基因的表达，作用于  特定的凋亡相关基因，从而抑制细胞凋亡，最近在心  血管领域中还发现其尚具有新的功能，作为一种心  肌保护蛋白被提出    ［4］    。本实验中，免疫组织化学结  果显示肺组织中COX-2蛋白在伤后4小时明显增  加，以后逐渐下降，但仍明显高于对照组，这种变化  与伤后PMN凋亡改变呈负相关（γ=-0.64），提示  家兔胸部撞击伤后肺内PMN凋亡抑制与COX-2表  达增加有一定关系。PGE    2    是一种非蛋白非多肽的  脂肪酸代谢产物，具有扩张血管、降低血压，使血管  通透性减少的作用，环氧合酶是其生成的主要限速  酶。本实验中伤后BALF中PGE    2    和COX-2表达均  明显升高，PGE    2    在伤后12小时达到最高值，峰值时  间迟于COX-2表达峰值。Liu等    ［5］    报道PGE    2    通过  增加PMN内cAMP浓度可延迟中性粒细胞凋亡，提  示COX-2表达增加对肺内PMN凋亡的抑制可能是  通过促进PGE   2    生成而介导的，能否利用诱导因子加  速诱导肺内PMN凋亡来改善ALI/ARDS发生和发  展，值得进一步探讨。  

    参考文献:   

    ［1］ Lee WL，Downey GP.Neutrophil activation and acute lung   injury［J］.Curr Opin Crit Care，2001，7（1）:1-7. 

    ［2］ 王建春，毛宝龄，钱桂生.LPS，TNF-α，IL-1β对大鼠多核  白细胞环氧合酶2表达的影响［J］.解放军医学杂志，  2003，28（2）:105-106. 

    ［3］ Rowe SJ，Allen L，Ridger VC，et al.Caspase-1-deficient   mice have delayed neutrophil apoptosis and a prolonged in-  flammatory response to lipopolysaccharide-induced acute   lung injury［J］.J Immunol，2002，169（11）:6401-6407.  

    ［4］ Bolli R，Shinmura K，Tang XL，et al.Discovery of a new   function of cyclooxygenase（COX）-2: COX-2 is a cardio-  protective protein that alleveiates ischemial reperfusion in-  jury and mediates the late phase of preconditioning［J］.  Cardiovasc Res，2002，55（3）:506-519. 

    ［5］ Liu J，Akahoshi T，Jiang S，et al.Induction of neutrophil   death resembling neither apoptosis nor necrosis by ONO-  AE-248: a selective agonist for PGE    2    receptor subtype 3  ［J］.J Leukoc Biol，2000，68（2）:187-193.