脓毒症与基因多态性相关性研究进展

    作者：文爱清，蒋建新   （第三军医大学大坪医院野战外科研究所四室，重庆 400042）    摘要:  脓毒症是机体对严重感染的全身反应，其预后与疾病的严重程度、治疗及机体的遗传背景等多种因素有关。遗传背景因素在脓毒症产生和转归中的作用日益受到重视。笔者现对与脓毒症相关的基因多态性进行以下综述。

    关键词: 脓毒症;基因;关联分析

    Sepsis and gene polymorphism

    WEN Ai-qing，JIANG Jian-xin

    （Institute of Surgery Research，Daping Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400042，China）

    Abstract: Sepsis is the systemic response to severe infection.Its prognosis is associated with many factors，such as severity and treatment of disease，and genetic background of the body.Genetic factors lay more and more emphasis on the pathogenesis and prognosis of sepsis.The author gave a general review on the concepts of gene polymorphism，and relation of some cytokines polymorphism to sepsis.

    Key words:sepsis;gene;association study

    脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征（systemic in-flammatory reaction syndrome，SIRS），是众多介质参与的复杂反应。随着分子生物学的快速发展，人们认识到，机体对感染或创伤的反应最终表现在细胞、组织、器官和整体层次上，但这些变化往往是以基因水平上的变化为基础的。研究业已表明，基因多态性（gene polymorphism）是人类个体对疾病易感性、疾病表型和对药物治疗反应差异性的重要原因之一。因此，探讨基因背景与脓毒症的关系，不仅有可能更加科学地认识脓毒症的发病机制，而且将为脓毒症的早期诊断和预后判定及治疗带来新的机遇。本文就脓毒症相关主要因子基因多态性进行综述，为其深入研究提供参考。

    1   肿瘤坏死因子基因多态性

    肿瘤坏死因子（TNF-α）是脓毒症休克主要炎症介质之一。目前在TNF基因上发现几个多态位点，其位点碱基的变异影响脂多糖（LPS）刺激时TNF-α的表达而与多种炎性疾病有关。

    1.1   TNF-α-308（G.A）多态性 在TNF-α启动子区离转录起始位点上游308个核甘酸处，一般有1个鸟嘌呤（G）位点，人群中第6号染色体大约80%在这个位点是鸟嘌呤，而在20%的人群以腺甘酸（A）代替了G。因为每个个体有2个拷贝的第6号染色单体，因此，每个个体的基因型可分为G.G、G.A、A.A。其相应的频率大约为68%～80%、15%～25%、2%～5%。含有G拷贝的通常指TNF1等位基因，A通常指TNF2等位基因，因此，G.G个体指TNF1.TNF1，以此类推。分布频率稀少的等位基因TNF2与体内外自发或刺激后TNF-α产生增加有关。Mira等［1］ 研究了法国89例脓毒症休克TNF2（含有A）的频率，对脓毒症易感性和转归与等位基因分布频率作了关联研究，研究结果显示对照和脓毒症休克病人TNF2等位基因的分布频率显著不同。而且，在脓毒症休克病人中，死亡者TNF2等位基因2（纯合子或杂合子）的分布频率高于未死亡者（52%:24%，P=0.008）。多重线性回归分析显示TNF2等位基因纯合子或杂合子的病人较TNF1等位基因纯合子的病人死亡率高（71.4%:42.6%），这意味着携带有至少1个拷贝的TNF2等位基因的病人死亡危险性增加3.7倍。TNF2等位基因的分布频率因人群的不同而不同，因此，TNF2与脓毒症的相关性也一样。Stüber等［2］ 对80例脓毒症病人的研究发现，TNF2多态性与严重脓毒症病人的转归无关联。相反，Tang等［3］ 对112例术后创伤病人的研究显示，一旦术后病人发展成脓毒症休克，TNF2等位基因与致死性转归有显著关联。TNF2不能预示病人是否发展成脓毒症休克，也不能预示病人是否死亡率较高。其结果的不一致提示TNF2等位基因的意义也可能依赖于另外其它未知标记分子的存在。

    1.2   TNFβ多态性

    在编码TNFα蛋白的基因附近有编码TNFβ的基因，后者也叫淋巴毒素α（lymphotoxinα，LTα）。在其内含子中含有A.G单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。常见的等位基因是TNFB2，它在第1个内含子1069位碱基是“A”，稀少的等位基因型是TNFB1，在相应的位置含有“G”。“G”（TNFB1等位基因）与DNA序列特异性限制酶NcoI的消化位点有关。研究显示内毒素和植物血凝素刺激TNFB2纯合子个体的单核细胞后，白细胞介素1（IL-1）和TNF-α产生增加［4，5］ 。以往的研究证明了TNFB2等位基因的存在与几种自身免疫疾病如I型胰岛素依赖性糖尿病和红斑狼沧等有关［4］ 。Stüber等［6］ 研究了40例严重脓毒症病人，发现病人与健康对照组所有的等位基因的分布频率和基因型分布无差异。但是非存活者在纯合子构型中等位基因TNFB2频率高（80%:44%存活者，P<0.05）。同一批研究者对110例严重钝性创伤病人进行研究，发现TNFB2纯合子病人严重创伤后发展成脓毒症进程加快。他们按年龄、创伤评分（ISS）及创伤模式对23例创伤后脓毒症与创伤后没有发展成脓毒症的病人作比较，发现严重创伤脓毒症病人TNFB1和TNFB2的等位基因频率分别为15%和85%;而没有发展成脓毒症病人TNFB1和TNFB2的频率分别为35%和65%。2   IL-1基因复合体多态性 IL-1也是脓毒症的主要前炎性细胞因子之一，IL-1基因复合体编码3种不同的蛋白:IL-1α、IL-1β、IL-1Ra。IL-1存在2种形式:IL-1α、IL-1β;它们与同一受体结合，有着相似的功能。IL-1Ra似乎是在细菌内毒素血症中起保护效应，在IL-1基因族已发现几个多态点，下面分别阐述。

    2.1   IL-1Ra A2多态性 IL-1Ra基因2号内含子多态性是由86bp的可变数量串联重复（variable number tandom repeat，VNTR）引起的。IL-1Ra有由86bp VNTR的2～5个重复序列组成5种等位基因。健康人群IL-1Ra A2携带者血浆IL-1Ra水平较A2等位非携带者高，他们的单核细胞在体外经LPS刺激后也产生高水平的IL-1Ra［7］ 。等位基因A2的频率增加与多种炎症相关［8，9］ ，就如TNFB2和脓毒症的关系一样，其结果与人群有关。Blakemore等［8］ 发现在英国人群中A2等位基因携带者对严重系统性红斑狼疮（SLE）易感。Danis等［10］ 在澳大利亚则没有发现这种相关性。

    2.2   IL-1β基因多态性 目前报道的发生在IL-1β上的多态性都是双等位型多态性，它们分别是发生在第5个外显子内的C+3953T和5'侧翼区的C-31T、T-511C。C+3953T变异同时造成1个TaqI限制性片段长度多态性（9.4kb和13.4kb）。T变异等位基因携带者的单核细胞表达IL-1β蛋白的能力较C等位基因携带者高［11］ 。IL-1βC+3953T多态性与各种疾病，如肠炎、风湿性关节炎、牙周炎等有关。关于IL-1β+3953多态性与脓毒症易感性的关系，没有发现其分布频率在病人和对照组之间有差异 ［12］ 。在IL-1β基因5'侧翼区离转录起始位点不远（-31bp）有1个SNP。其位置刚好处于TATA盒上。由于T替代C碱基，使得CATAA变为TATAA，生物信息学分析推测-31位点为T时能增强IL-1β的转录进而增强IL-1β的表达。体外实验已证明了-31C变为T时影响了LPS刺激条件下DNA和TATA结合蛋白（TBP）的结合［13］ 。许多学者对IL-1β-31SNP与多种疾病的易感、转归作了探索，研究最多的首推IL-1β-31SNP与胃中幽门螺杆菌感染及胃炎、胃癌的关系。由于IL-1β能抑 制胃酸的分泌，IL-1β基因C-31T可能影响IL-1β的产生而与由幽门螺杆菌（HP）感染诱导的胃酸分泌过少和胃癌发生率增加有关［13，14］ 。另外，它们也与牙周炎、脑膜炎球菌性脑膜炎、肠炎等多种疾病的发生或预后有关［15，16］ 。目前关于该SNP是否与全身炎症反应综合征或严重创伤病人的脓毒症易感性或预后有关，未见报道。发生在IL-1β启动子区的另1个SNP（T-511C）17］ ，相关报道也比较多。它也与多种炎性疾病的进展有关［15，17］ 。但应用EMSA实验证明了IL-1β-511C替换T后不能改变与核蛋白的结合活性。有学者提出-511的效应是通过与-31SNP的连锁不平衡而介导的 ［13］ 。总而言之，关于IL-1β-31和-511SNP与炎症等疾病的关系报道较多，但都限于关联分析。对它们更进一步的功能研究，即它们在IL-1β转录与调控中的作用等还值得进一步研究。

    3   丝裂原活化抑制因子（PAI-1）基因多态性

    在PAI-1基因启动子区存在1个有功能的多态性，即单个碱基的插入（5G）或缺失（4G）。这个多态性在调节PAI-1基因表达中有重要的作用。感染脑膜炎双球菌的病人有些发展为脓毒症休克，而有些则只发展到菌血症或脑膜炎。Westendorp等［18］ 通过研究PAI-1基因多态性来分析其中是否有遗传上的变异，为此检测了50例感染脑膜炎双球菌的病人、183名感染此菌的病人第一直系亲属和131名正常对照组PAI-1的4G、5G基因型分布和等位基因频率。结果发现，携带4G.4G基因型的感染病人发展成脓毒症休克的风险概率是携带其它基因型病人的5倍，而第一直系亲属携带该基因型的感染病人发展成脓毒症休克的风险概率是第一直系亲属携带其它基因型的感染病人的6倍。 Menges等［19］ 的研究结果表明了PAI-1基因多态性与严重创伤病人脓毒症易感性的关系。发现84%的基因型为4G.4G的严重创伤病人并发脓毒症，而基因型为4G.5G和5G.5G的严重创伤病人并发脓毒症的比例分别是38%和15%。其结果还表明，PAI-14G等位基因和血浆中高PAI-1浓度有关，而且基因型为4G.4G的严重创伤病人其死亡率（58%）显著高于基因型为4G.5G（28%）和5G.5G（15%）的严重创伤病人。

    4   IL-10基因多态性

     IL-10是重要的抗炎因子，能抑制单核-巨噬细胞系统活化以及单核因子和炎症细胞因子的合成，具有免疫调节作用，因此在脓毒症发生和发展中起重要作用。IL-10基因多态性见于其启动子区域的3个单核苷酸位点:-1082（G→A）、-819（C→T）、-592（C→A）。其多态性位点每个均含有2个等位基因（1和2），构成3种基因型（纯合子1.1、2.2及杂合子1.2）。其中-1082位点G被A置换后使淋巴细胞合成IL-10水平降低，且这3个位点间呈现连锁不平衡现象［20］ 。方向明等［21］ 应用PCR结合RsaⅠ、MeaⅢ、MnlⅠ限制性内切酶酶切分析法检测了116例术后并发严重脓毒症患者和141例健康献血员IL-10-592、-819、-10823个位点的多态性。结果发现IL-10-1082位点的多态性与术后严重脓毒症的易感性有关，与其预后不相关，而IL-10-592、-8192个位点的多态性与术后严重脓毒症的易感性及预后均不相关。5   热休克蛋白（HSP-70）基因家族多态性 HSP-70是进化上比较保守的蛋白质，由3个基因编码，均在人白细胞抗原Ⅲ（HLAⅢ）基因区域内，和TNF基因相邻，被命名为HSP70-1、HSP70-2和HSP70-HOM。HSP70-1和HSP70-2编码的蛋白质完全相同，HSP70-HOM编码的蛋白质和前者有90%的同源性（Homology），故称为HSP70-HOM。HSP70基因多态性较少，研究较多的是HSP70-HOMNcoI限制性多态性和HSP70-2PstI限制性多态性。前者导致HSP70-HOM蛋白质肽链中氨基酸的改变，即蛋氨酸变为苏氨酸，后者导致HSP70-2mRNA表达的变异。Schroeder等［22］ 进行了HSP70-2和HSP70-HOM基因多态性与脓毒症易感性及转归方面的研究，并分析了HSP70等位基因和TNF-β等位基因的连锁情况。检测了87例脓毒症病人和110例健康人HSP70-2G.A和HSP70-HOM C.T的多态性情况，发现HSP70-2PstI基因多态性和HSP70-HOM NcoI限制性多态性不管是基因型分布还是等位基因频率，两组均无显著性差异，而且在脓毒症病人生存者和死亡者之间也无显著性差异，但发现脓毒症病人HSP70-2A纯合子和TNFB2纯合子之间有连锁存在。认为HSP70基因多态性与脓毒症易感性及转归均无关联的原因是:研究HSP70基因多态性和脓毒症的关系主要从HSP70基因多态性调节、转录、变异的角度来考虑，而蛋白质表达调控的机理是多方面的，HSP70基因多态性调节蛋白质表达可能不单表现在转录水平上。

    6   问题与展望

     虽然脓毒症遗传学研究得到快速的发展，但是在其早期诊断和防治上并未取得重要突破。分析其主要原因，是目前许多研究常常孤立地针对1个或几个基因分子研究脓毒症的发生机制;另外，大多数研究多局限于基因多态性与疾病的关联分析，较少深入探讨其内在联系，对已得到与脓毒症发生或预后相关基因标记物还缺乏明确的功能验证;在研究方法上，多数实验室采用较为传统简便的限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）检测法，而这种方法只能进行单点单核苷酸多态性（SNP）的分析。目前，基因多态性的研究方法虽存在一定的局限性，但是合理设计的相关性研究仍是探寻复杂疾病基因背景的有效方法。近年来出现的DNA微矩阵技术可以高通量筛选及检测与脓毒症有关的SNP，从基因组层次上大规模分析基因多态性与疾病的关系，更为全面地揭示疾病发生的分子机制。虽然阐明基因多态性与疾病的关系虽有漫长的路程，但基因多态性研究将为我们深入剖析疾病的发病机制，探索疾病表型多样性产生的本质，发展更具个体化的临床治疗措施开辟一个全新的领域。

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