巴曲酶用药次数对脑缺血再灌注沙土鼠脑保护作用的影响
发表时间：2010-02-04 浏览次数：666次
巴曲酶用药次数对脑缺血再灌注沙土鼠脑保护作用的影响作者：徐连宝, 印卫兵, 丁新生,龚洁 作者单位：210029南京医科大学第一附属医院神经内科 【摘要】 目的 研究巴曲酶用药次数对脑缺血再灌注（IR）沙土鼠脑保护作用的影响。方法 沙土鼠45只，随机分为IR模型组、正常组、巴曲酶3次用药组（3次组）、5次用药组（5次组）和7次用药组（7次组）。采用双侧颈总动脉夹闭5 min后再通建立沙土鼠脑IR损伤模型。3次组、5次组、7次组均在造模成功后腹腔注射巴曲酶(8 BU/kg)，隔日1次，分别给药3次、5次、7次；IR模型组和正常组腹腔注射等量的生理盐水，共7次。用流式细胞仪检测各组沙土鼠海马区凋亡细胞数，电镜观察海马CA1区细胞形态。结果 巴曲酶3次组、5次组和7次组海马区凋亡细胞数显著少于IR组（均P<0.05）；5次组海马区凋亡细胞数明显少于3次组（P<0.05），而5次组与7次组之间差异无统计学意义(P>0.05)；正常组仅有极少凋亡细胞。5次组细胞超微结构改变要轻于3次组，与7次组相比无明显差异。结论 巴曲酶3次、5次和7次用药均可减少脑IR后神经元的凋亡；但5次和7次用药的脑保护作用明显好于3次用药。 【关键词】 脑缺血再灌注 巴曲酶 凋亡 神经保护 Influence of applied times of Batroxobin on neuroprotective effects in cerebral ischemicreperfusion injury gerbils XU Lianbao, YIN Weibing, DING Xinsheng，et al.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China Abstract：Objective To study the influence of applied times of Batroxobin on neuroprotective effects in cerebral ischemicreperfusion(IR) injury gerbils. Methods 45 gerbils were randomly divided into five groups: normal group; cerebral IR injury model group(IR group);three times group;five times group; seven times group. The later three groups were administered Batroxobin 8 U/kg by abdominal injection q.o.d with certain times respectively.The normal group and IR group were not given drug but isometric physiological saline. Flow cytometer was used to measure apoptotic neurons of the hippocampal CA1, meanwhile electronic microscope was used to detect the ultrastrctural change of the hippocampal CA1 region. Result The quantity of apoptotic neurons in the every Batroxobin groups were significantly less than those in the IR groups(all P<0.05), but the quantity of apoptotic neurons in five times group was significant less than that in three times group(P<0.05). However, no significant difference was found between five times group and seven times group (P>0.05). The ultrastrctural changes in five times group were lighter than those in three times group, but no significant difference was found between five times group and seven times group. Conclusion Three times, five times and seven times of Batroxobin can reduce the number of apoptotic neurons after IR injury. However, applied five times and seven times of Batroxobin has stronger neuroprotective effect than three times. Key words：cerebral ischemiareperfusion; Batroxobin; apoptosis; neuroprotection 巴曲酶具有降低纤维蛋白原、抗血栓、清除氧自由基及抗脂质过氧化等神经保护作用［1］。巴曲酶在临床的常规用法为3次隔日用药，经过大规模临床应用取得了较好的效果［1，2］，但增加用药次数能否产生最佳的脑保护作用尚无相关的报道。为此，本研究探讨巴曲酶用药次数对脑缺血再灌注（IR）沙土鼠脑保护作用的影响。现报告如下。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物及分组 成年雄性蒙古沙土鼠(浙江省实验动物中心提供) 45只,质量60～70 g，随机分成巴曲酶3次用药组（3次组）、5次用药组（5次组）、7次用药组（7次组）、IR组和正常组，每组9只。 1.1.2 主要试剂及仪器 巴曲酶(东菱迪芙,北京东菱医药生物科技有限公司)；电镜和流式细胞仪。 1.2 方法 1.2.1 IR模型制作 给沙士鼠用2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，行颈部正中切口分离暴露双侧颈总动脉，用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5 min后松开动脉夹形成前脑缺血再灌注模型。术中观察有瞳孔散大，翻正反射消失表明造模成功。造模过程中有瞳孔固定、癫疒间发作的沙土鼠予以剔除。 1.2.2 巴曲酶干预 3次组、5次组及7次组在造模术后当天起给予巴曲酶8 BU/kg［2］，腹腔注射，隔日1次，按组给予相应次数用药。IR组和正常组给予腹腔注射等量生理盐水，隔日1次，共7次。 1.2.3 凋亡细胞检测 各组取6只沙土鼠，在造模后第14 d给予2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,快速断头取脑,并取双侧海马立即用流式细胞仪检测凋亡细胞。 1.2.4 超微结构观察 每组取3只沙土鼠，2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,断头取脑,取双侧海马CA1区组织修剪至1 mm3大小，用戊二醛和锇酸进行双重固定,丙酮脱水,环氧树脂包埋, 超薄切片机切片(片厚50～100 nm),再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色,透射电镜观察。 1.2.5 统计学方法 计量数据以均数±标准差(±s)表示,采用SPSS 10. 0统计软件对样本均数进行t检验，组间差异采用Oneway ANOVA分析。2 结果 2.1 不同次用药组及IR组凋亡细胞数比较 见表1。各次用药组凋亡细胞数显著少于IR组(均P<0.05)。5次组凋亡细胞数显著低于3次组(P<0.05), 5次组与7次组相比差异无统计学意义(P>0.05)。正常组仅有极少凋亡细胞［(0.3567±0.12258)%］。 表1 各组沙土鼠海马CA1区凋亡细胞数比较（略） 注：与IR组比较*P<0.05;与3次组比较△P<0.05 2.2 超微结构改变 IR组海马CA1区神经元胞质内空泡明显，线粒体肿胀，部分膜崩解，粗面内质网腔扩大，核膜部分皱折，染色体聚集靠边，附于核膜碎裂。巴曲酶3次组神经元有明显染色体断裂、靠近核膜，核膜皱折，胞质内细胞器空泡样变等改变，5次组和7次组神经元胞质内空泡样变不明显，核膜完好，核内染色质无明显聚集现象（图1）。 图1 a：正常组沙土鼠海马CA1区神经元结构正常；b：IR组神经元胞浆空泡明显、细胞器肿胀、胞核核膜皱折，染色体边聚、断裂；c：3次组神经元核周有空泡，胞质内细胞器肿胀，染色体有断裂；d、e：5次组和7次组神经元改变轻，接近正常组（×10 000）（略）3 讨论 脑IR损伤是基于脑缺血、脑出血、脑血管畸形等疾病基础之上的重要病理过程。脑IR产生大量的炎性因子、氧自由基、凋亡因子而加重原来的缺血损害，其神经元损伤机制包含凋亡与坏死两种方式［3］，凋亡可持续数周，经适当治疗可逆转凋亡的病理过程,改善预后。在脑IR损伤过程中海马组织对缺血尤为敏感,在海马内部各区锥体细胞缺血易损伤性的顺序是: CA1及门区>CA2>CA3>齿状回［4。5］ ,所以选择用海马组织来检测凋亡细胞以及用CA1区细胞来观察超微结构改变。 巴曲酶是一种有效的脑保护药物，在缺血性脑血管病的临床治疗中已广泛应用，而且有一定的时间窗，一般在缺血后72 h内开始使用，常规用法为3次隔日用药［1］。本实验结果显示巴曲酶各次用药组海马凋亡细胞数显著少于IR组（均P<0.05），印证了巴曲酶的脑保护作用；但同时发现5次组凋亡细胞数要显著少于3次组（P<0.05），而7次组和5次组相比差异无统计学意义（P>0.05），这说明>3次用药的脑保护作用要好于3次用药，但是>5次用药的脑保护作用并不明显好于5次用药，这提示5次用药可能是达到脑保护作用的最佳给药次数。 超微结构观察显示IR组细胞凋亡显著，胞质内空泡明显，线粒体肿胀，部分膜崩解，粗面内质网腔扩大，核膜部分皱折，染色体聚集靠边，附于核膜碎裂。巴曲酶3次组细胞超微结构改变轻于IR组，但仍可见到胞质内细胞器空泡样变，核周空泡，染色质仍有断裂靠近核膜的现象，可见到凋亡小体。5次组的海马CA1区细胞结构损伤要明显轻于3次组，胞质内空泡较少，核膜相对完整。而7次组和5次组超微结构改变不明显，这也表明5次和7次用药的效果要好于3次用药。 研究［6-8］证实巴曲酶是通过上调Bcl2、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血管内皮生长因子（VEGF）、Akt蛋白表达以及通过调节细胞钾通道活性来达到脑保护作用。但是巴曲酶有很强的降低纤维蛋白原的作用［9］，我们的预试验结果也提示巴曲酶5次用药和7次用药能明显降低血纤维蛋白原浓度。本实验结果提示巴曲酶5次用药是脑保护作用最佳给药次数，但临床应用时必须监测血纤维蛋白原浓度，以防纤维蛋白原浓度太低导致脑出血［10］。【参考文献】 ［1］陈清棠，王颖，吴祖舜，等.巴曲酶注射液治疗急性脑梗死的临床试验［Ｊ］.中风与神经疾病杂志，2002，19：27. ［2］印卫兵,丁新生,冯美江,等.不同剂量巴曲酶对脑缺血沙土鼠的脑保护作用［Ｊ］.临床神经病学杂志,2005,18:124. ［3］Benchoua A, Guegan C, Couriaud C, et al. 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