外周血多形核白细胞凋亡情况及生存率与急性胰腺炎严重程度相关性研究

　　作者：孙纲，高建军 作者单位：(解放军第210医院 普通外科，辽宁 大连 116021)

　　【摘要】目的 研究急性胰腺炎大鼠模型外周血多形核白细胞即中性粒细胞(PMN)的凋亡情况及生存率与急性胰腺炎严重程度的关系。方法 采用在大鼠胰胆管共同通道内逆行注射不同浓度的脱氧胆酸钠，制备不同严重程度的急性胰腺炎模型。18只SD大鼠随机分为对照组、模型1组(0.75%脱氧胆酸钠剂量组)、模型2组(1.5%脱氧胆酸钠剂量组)。分别于造模后6 h 处死各组存活大鼠。观察各组大鼠的胰腺组织病理学变化、组织病理学评分，血清、腹水淀粉酶水平，腹水量及外周血清IL6、IL8水平。同时用TUNEL法分析外周血多形核白细胞凋亡情况，用流式细胞分析法分析外周血多形核白细胞存活率。并与急性胰腺炎严重程度各项指标进行统计学相关分析。结果 模型1组大鼠较模型2组大鼠胰腺组织坏死及出血程度轻，组织病理学评分低，腹水及血清淀粉酶水平低，腹水量相对少,外周血清IL6，IL8水平低;病变程度较轻的模型1组大鼠外周血多形核白细胞凋亡指数比病变重的模型2组大鼠高(30±6 vs 20±4 P<0.05);病变程度较轻的模型1组大鼠外周血多形核白细胞存活率比病变重的模型2组大鼠低[(56.12±4.21)% vs (67.15±5.11)%， P<0.05]。结论 急性胰腺炎时，外周血多形核白细胞凋亡指数与急性胰腺炎严重程度呈负相关，外周血多形核白细胞存活率与急性胰腺炎严重程度呈正相关。

　　【关键词】 多形核白细胞;凋亡;存活率;急性胰腺炎

　　Correlativity between Apoptosis of Polymorphonuclear Neutrophil and Severity of Acute Pancreatitis in Rats

　　Sun Gang, Gao Jianjun

　　(Department of General Surgery, PLA No.210 Hospital, Dalian 116021, China)

　　Abstract： Objective To study the relationship between apoptosis index and and severity of acute pancreatitis (AP) in rats.Methods The different severities of acute pancreatitis models of SD rats were established by retrograde injection with different concentrations of sodium deoxycholate into the common bilepancreatic duct of the rats. The rats (n=18) were divided at random into control group, AP1 group (0.75% dose group) and AP2 group (1.5% dose group). The apoptosis indexes of polymorphonuclear neutrophils (PMNs) in acute pancreatitisis were analysed by TUNEL method, and the survival rates of PMNs were measured by flowcytometry analysis.Results The apoptosis index was higher in the AP1 group than in the AP2 group (30±6 vs 20±4, P<0.05), whereas the survival rate was lower in the AP1 group than in the AP2 group [(56.12±4.21)% vs (67.15±5.11)%, P<0.05]. Conclusion The apoptosis index of PMNs is inversely related to the severity of AP, whereas the survival rate of PMNs is positivily related.

　　Key words： polymorphonuclear neutrophil; apoptosis index; survival rate; acute pancreatitis

　　多形核白细胞即中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)作为炎症反应的重要标志物之一，在炎症反应的各个阶段发挥着重要作用[1]。据以往研究[2]表明在急性胰腺炎病程中PMN的凋亡是一种保护现象，可延缓急性胰腺炎的病变发展。当PMN进入抗感染状态时，其寿命比正常循环中的PMN半衰期明显延长，其存活及凋亡情况对炎症发展起着重要作用。外周血PMN的凋亡指数及生存率客观反应出外周血PMN的存在方式及组成成分，且可能与急性胰腺炎严重程度存在相关性。我们采用不同药物浓度制备不同严重程度的急性胰腺炎大鼠模型，观察各组大鼠的胰腺组织病理学变化、组织病理学评分，血清、腹水淀粉酶水平，腹水量及外周血清IL6、IL8水平等指标以确定急性胰腺炎病变严重程度，同时应用TUNEL方法分析外周血PMN的凋亡指数及应用流式细胞分析法分析外周血PMN的存活率。最终分析外周血PMN凋亡及存活率与急性胰腺炎大鼠模型严重程度的相关性。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂及仪器

　　(1)淋巴细胞分离液： 上海恒信化学试剂有限公司产品;(2)原位细胞凋亡检测试剂盒(POD)：德国ROCHE公司产品;(3)DAB：北京中杉金桥生物技术有限公司;(4)EPICSXL 流式细胞仪：美国贝克曼库尔特公司;(5)SD大鼠：中国医科大学动物试验室;(6)IL6、IL8 ELISA Kit：美国Genzyme Co;(7)Annexin VFITC Kit：深圳晶美生物工程有限公司。

　　1.2 实验动物及方法

　　1.2.1 选用健康SD大鼠18只，雌雄各9只，体重230～250 g，随机分为对照组，模型1组，模型2组。其中，对照组仅常规开腹，翻动胰腺;模型1组、模型2组分别为胰胆管内注射浓度为0.75%、1.5%的脱氧胆酸钠制备的急性胰腺炎模型组。给药后6h经静脉放血处死各组存活大鼠。

　　1.2.2 各组留取外周血5 ml，肝素抗凝，注入已经预置5 ml 浓度为30 g/L葡萄糖T 500离心管中，混合均匀;将离心管于恒温箱中37℃静置45 min，使RBC沉降;取上层液，以1 000r/min、离心半径10 cm 离心10 min，去上清;将沉淀重悬于含3%小牛血清的PBS中，铺放在等体积的淋巴细胞分离液上，以1 000 r/min 离心半径10 cm 水平离心20 min，去上清;加入1 ml 0 ℃ 无菌蒸馏水，静待30 min，溶解剩余的RBC;加入1 ml 20 g/L氯化钠溶液，构成等渗液，以1 000 r/min 离心半径10 cm离心10 min，去上清;将沉淀以PRMI 1640培养液以1 000 r/min、离心半径10 cm 离心10 min，共2次;以含10%热灭活新生牛血清、青霉素钠100 U/ml、链霉素100 U/ml 的RPMI 1640培养液悬浮细胞，调整细胞浓度为5×106/ml;应用苔盼蓝拒染法测定，PMN纯度>95%;将分离的各组PMN分别接种于24孔培养板，每孔细胞数5×106(2 ml);将培养板放置于CO2培养箱中，在37 ℃，饱和湿度，5%的CO2条件下孵育24 h[3]。

　　1.2.3 与此同时快速切取各组胰腺组织标本，置于20%中性磷酸盐缓冲液—甲醛中固定，4 μm 连续切片，行常规HE染色。

　　1.2.4 留取各组标本适量血清供测定淀粉酶及IL6、IL8水平;留取各组腹水供腹水量及腹水淀粉酶水平测定。

　　1.3 观察指标及具体观察方法

　　1.3.1 光镜下胰腺组织病理学改变。常规制作病理HE切片。方法按临床病理学切片检查方法进行。观察各组胰腺组织病变程度及按照Kyogoku法进行组织病理学评分。

　　1.3.2 血清淀粉酶及腹水淀粉酶测定。采用全自动生化分析检测仪。

　　1.3.3 腹水量测量。浸满腹水纱布重量与浸湿前的干纱布重量之差即为腹水量。

　　1.3.4 外周血清IL6，IL8水平检测。采取血样后，立即进行离心，留取血清采用ELISA法进行检测。

　　1.3.5 用TUNEL方法检测外周血PMN凋亡指数。其方法原理为：在末端脱氧核糖核酸转移酶介导下，使荧光素标记的脱氧尿苷三磷酸混合到凋亡细胞DNA片断的3’OH末端，利用标记辣根过氧化物酶的羊抗荧光素的Fab段抗体于荧光素特异结合，通过DAB显色，凋亡细胞的细胞核染色为棕色，部分细胞浆也因核DNA碎片的溢出呈现阳性染色。在凋亡阳性细胞分布区，400×光镜下随机观察连续10个高倍镜视野，以平均每100个细胞含凋亡细胞个数为凋亡指数(apoptosis index)。

　　首先收集细胞以1×107/ml 滴片，干燥后用4%多聚甲醛室温固定1h;PBS冲洗3次;加3%H2O210 min;再次PBS冲洗3次;加0.1%TritonX100冰上2 min ;再次PBS冲洗3次;滴加50 μl 的TUNEL反应混合液体37 ℃ 湿盒避光孵育1 h;再次PBS冲洗3次;荧光显微镜下观察，滴加50 μl POD，在37 ℃ 湿盒中孵育30 min，期间加盖盖玻片;再次PBS冲洗3次;滴加DAB显色液显色，显微镜下观察控制显色时间;冲洗，苏木素复染细胞10 min，流水返蓝10 min;脱水，透明，中性树胶封片。

　　1.3.6 用流式细胞分析法分析外周血PMN存活率。PMN生存率为除凋亡及坏死的PMN以外，起正常生理作用的生存PMN细胞占所有PMN细胞的比例。使用流式细胞分析法(AnnexinV/PI双染法)，可直观了解各组胰腺炎外周血PMN存活数量及存活率。

　　培养PMN细胞24 h 后收集PMN细胞;用去离子水按1：4稀释结合缓冲液;用4 ℃ 的冷PBS洗细胞2次，用250 μl　结合缓冲液重新悬浮细胞，并使其浓度为1×106/ml;取100 μl 的细胞悬液于5 ml 流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC和10 μl 20 mg/L 的碘化丙锭溶液，混匀后于室温避光孵育15 min;在反应管中加400 μl PBS，流式细胞分析仪分析。AnnexinV阳性为凋亡细胞，PI阳性为坏死细胞，AnnexinV及PI双阴性为存活细胞。

　　1.4 统计学方法

　　用SPSS8.0 统计软件进行处理，检测数据以均数±标准差(x±s)表示，并采用t检验和方差分析等方法进行相关统计学分析。

　　2 结果

　　2.1 光镜下胰腺组织病理学改变

　　对照组胰腺组织为正常改变;造模后6 h，模型1组胰腺间质明显水肿，炎性浸润，胰腺实质可见少量出血及坏死，小静脉扩张，红细胞沉积，粒细胞聚集和黏附;造模后6h，模型2组胰腺实质出现坏死、出血及大量脂肪坏死，大量红细胞沉积，血管扩张，可见粒细胞聚集黏附，浸润至组织间隙，病理学改变较模型1组明显严重。

　　由表1可见病变轻的模型1组的胰腺实质出血、实质坏死、空泡形成的病理评分值和总分值均低于病变重的模型2组，且差异有统计学意义(P<0.05)。表1 各组胰腺组织Kyogoku法组织病理学评分(略)

　　2.2 腹水和血清淀粉酶及腹水量测定结果

　　由表2可见病变轻的模型1组腹水淀粉酶、血清淀粉酶及腹水量较病变重的模型2组低，且差异有统计学意义(P<0.05)。表2 各组大鼠腹水淀粉酶、血清淀粉酶及腹水量的比较(略)

　　2.3 外周血清IL6、IL8水平检测结果

　　由表3可见病变轻的模型1组外周血清IL6、IL8水平较病变重的模型2组低，且差异有统计学意义(P<0.05)。表3 各组大鼠外周血IL6、IL8水平比较(略)

　　2.4 外周血PMN凋亡情况及凋亡指数(TUNEL方法)结果

　　凋亡指数对照组为35±7，模型1组为30±6，模型2组为20±4。提示随着胰腺炎严重程度的加剧，PMN凋亡指数降低，比较模型1组及模型2组，有统计学意义(P<0.05)。

　　2.5 外周血PMN存活率(流式细胞分析法)情况

　　PMN存活率对照组为(44.11±5.63)%，模型1组为(56.12±4.2)%，模型2组为(67.15±5.11)%。由此可见随着胰腺炎严重程度的加剧，PMN存活率升高，且有统计学意义(P<0.05)。第5期外周血多形核白细胞凋亡情况及生存率与急性胰腺炎严重程度相关性研究 孙 纲，等

　　2.6 外周血PMN凋亡指数及存活率与胰腺炎病变严重程度相关性

　　由表4、5可见大鼠外周血PMN凋亡指数与胰腺炎严重程度呈负相关，PMN存活率与胰腺炎严重程度呈正相关。表4 外周血PMN凋亡指数与胰腺炎严重程度相关性(略)表5 外周血PMN生存率与胰腺炎严重程度相关性(略)

　　3 讨论

　　急性胰腺炎， 尤其是重症急性胰腺炎常常并发SIRS，进而发展为MODS，使治疗难度加大，死亡率升高。而根据Jimenez等[4]研究指出， 急性胰腺炎时， 炎症反应消退依赖于PMN凋亡，急性胰腺炎患者外周血PMN凋亡明显受到抑制。PMN是机体防御系统的组成部分，有“机体卫士”之称，是机体首先对创伤、感染防御反应的关键环节[5]，它可迅速反应并渗出循环系统，进入炎症区域，通过释放蛋白酶和氧化代谢产物，如氧自由基等杀灭入侵的病原微生物和吞噬坏死组织，是机体对创伤、感染防御反应的关键环节，也是组织修复的开始阶段。PMN的生理效应是通过其增殖和分泌功能进行调节的。PMN的数量及功能的变化与急性胰腺炎的发生、发展相关。当PMN进入炎症部位时，其寿命明显延长，衰老的PMN在没有细胞因子和促炎介质条件下发生凋亡，凋亡的PMN不发生细胞膜的破裂，完整被吞噬而不释放其毒性细胞内容物。另外，巨噬细胞吞噬凋亡PMN不会激活巨噬细胞释放炎症介质，它们产生趋化因子和细胞因子的能力大大减弱，可以减轻组织损伤及控制炎症严重程度[6]。而循环中生存的PMN更是对抗感染起到了重要作用[7]。在重症急性胰腺炎时启动了单核巨噬细胞释放多种细胞因子如肿瘤坏死因子、白介素等，刺激PMN内凋亡抑制蛋白，抑制PMN内源性凋亡过程，使PMN寿命延长，免疫功能下降，进而释放更多的炎症介质，形成恶性循环[8]。本质上细胞凋亡是基因控制下的程序性细胞死亡的过程，包括Fas在内的多种基因起到调控作用。例如有研究表明PMN凋亡延迟与作为Fas的配体和蛋白酶途径过程中的重要组成成分的Fasl和Caspase3，6，7，8表达下调有关，同时患者外周血PMN凋亡延迟与Caspase3，9激活减少，进而激活NFkB有关[9]。

　　通过本研究发现，随着各组急性胰腺炎模型病变严重程度的增加，血清IL6， IL8水平、血清淀粉酶、腹水淀粉酶、腹水量及组织学病理评分较对照组模型逐步升高。而本研究的研究对象则随着急性胰腺炎严重程度的增加，外周血PMN凋亡指数降低，外周血PMN生存率增高。 大鼠外周血PMN凋亡指数与急性胰腺炎严重程度呈负相关，外周血PMN存活率与急性胰腺炎严重程度呈正相关。对PMN凋亡指数及生存率的研究为尝试进一步开发诱导PMN凋亡并减少其生存率的药物提供一定的理论依据。已有的可行性研究也大多围绕研究PMN凋亡过程及调控机制而进行。如何控制凋亡、坏死、生存的PMN相关研究可能会对临床起到指导作用。

　　【参考文献】

　　[1] Hilver ER,Cadwallader KA,Reed RJ, et al. The function and fate of neutrophils at the inflamed site prospects for therapeutics intervention[J]. JR Coll Physicians Lond,2000,1(34):68-74.

　　[2] 尚东. 全身炎症反应综合征中性粒细胞凋亡信号机制异常的研究进展[J].国际外科学杂志，2006，33(2)：121.

　　[3] SongChou H,MingHo H,ChangYouh T,et al.The expression of gene modulating programmed cell death in normal human polymorphonuclear neutrophils[J].Biochem Biophys Res Commun,1997, 233(3): 700-706.

　　[4] Jimenez M,Watson WG,Parodo J,et al.Dysregulated expression of neutrophil apoptosis in the systemic inflammatory responsesyndrome[J].Arch Surg, 1997, 132(5):1263-1270.

　　[5] Polverini PJ, Nor JE. Apoptosis and predisposition to oral cancer[J]. Crit Rev Oral Biol Med,1999,10:139-152.

　　[6] Fadok VA,Bratton DL,Konowal A,et al.Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/paracrine mechanisms involving TGFbeta, PGE2,and PAF[J].J Clin Invest,1998,101(4):890-898.

　　[7] Akgul C,Moulding DA,Edwards SW.Molecular control of neutrophil apoptosis[J].FEBS Lett,2001,487(3):318-322.

　　[8] Le’Negrate G, Rostagno P, Auberger P,et al.Downregulation of caspases and Fas ligand expression,and increase lifespan of neutrophils after transmigration across intestinal epithelium[J].Cell death and Differentiation, 2003, 10(2): 153- 162.

　　[9] Taneja R,parodo J,Jia SH,et al.Delayed neutrophil apoptosis in sepsis is associated with maintenance of mitochondrial transmembrane potential and reduced caspase9 activity[J].Crit Care Med, 2006, 32(7): 1460-1469.