新型生物人工肝系统治疗急性肝衰竭犬后猪内源性逆转录病毒传播的实验研究

　　作者：陈钟，陈瑞新，丁义涛，田鹏鹏，周卉 作者单位：南通大学附属医院普外科，南通226001;1南京大学

　　【摘要】 目的：探讨猪肝细胞为基础的新型生物人工肝(BAL)系统体外灌流后及治疗急性肝衰竭(ALF)犬后猪内源性逆转录病毒(PERV)的传播。方法：构建新型BAL，应用BAL进行体外灌流6h。采用门腔分流及胆总管结扎切断术建立犬ALF模型，应用BAL治疗ALF犬6h。采用PCR检测灌流前猪细胞中PERV原病毒DNA和猪mtDNA，采用RT-PCR检测灌流前后中空纤维管内腔循环液和治疗前后犬血清PERV RNA。结果：猪细胞可检测到PERV原病毒DNA和猪mtDNA，灌流前后中空纤维管内腔循环液和犬血清PERV RNA均为阴性。结论：猪肝细胞为基础的新型BAL体外灌流和用于ALF犬治疗6h后未发现PERV传播。

　　【关键词】 肝功能衰竭;生物人工肝系统;猪内源性逆转录病毒;逆转录-聚合酶链反应

　　Experimental study of the transmission of porcine endogenous retrovirus in treatment of bioartificial liver system for acute liver failure canines

　　CHEN Zhong, CHEN Ruixin, DING Yitao, et al (Department of General Surgery, the Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To study the transmission of porcine endogenous retrovirus after perfusion in vitro and treatment for acute liver failure canines using bioartificial liver system based on porcine hepatocytes. Methods：The novel bioartificial liver system (BAL) was constructed. The hepatocyte suspensions were circulated in BAL system for 6h. ALF was induced by end-side portocaval shunt combined with common bile duct ligation and transection. BAL was used to treat acute liver failure canines for 6h. PCR was used for detection of PERV of porcine hepaocytes. RT-PCR was used for detection of PERV RNA of circulated liquid in the hollow fiber calibers and serum of canines pre-circulation to post-circulation. Results：The results showed that PERV was detectable in porcine hepaocytes and PERV RNA was not detectable in the circulated liquid and sera of the canines pre-circulation and post-circulation. Conclusion：The spread of PERV had not been found after circulation of 6h in vitro and treatment of 6h for ALF canines using the novel BAL system based on porcine hepatocyte.

　　[Key words] Liver failure/treatment; Bioartificial liver system; Porcine endogenous retrovirus; Revere transcriptase polymerase chain reaction

　　近年来生物人工肝(Bioartifical liver, BAL)成为人工肝研究的重点，有望成为急性肝衰竭治疗的有效手段[1]。由于人肝细胞的短缺，猪肝细胞因其来源广泛、功能与人肝细胞相近，成为BAL较理想的肝细胞来源[2]。但猪基因组中整合的内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)的释放致人体细胞的感染可能性是猪肝细胞应用中面临的一大问题。我们在成功构建新型BAL后，通过体内外循环灌流研究PERV传播的可能性，为猪肝细胞为基础的BAL应用的安全性提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与仪器 BIOLIV A3A中空纤维管生物反应器(购自香港细胞生物有限公司)。RPMI1640培养基、新生牛血清购自Gibco公司。PCR主要试剂：蛋白酶K、RNA PCR Kit (AMV) Ver 2.1和Marker DL2000均购自TaKaRa公司;扩增仪为Gene Amp PCR System 2400(Perkin Elmer);凝胶成像仪为上海四星生物技术有限公司生产，型号SX-100。

　　1.2 方法

　　1.2.1 猪肝细胞的制备及活率检测 中国实验用小型猪(n=5)，雌雄不限，体重2～4kg。采用原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞[2]。台盼蓝法检测细胞活率。取肝细胞以5×106个/ml接种到含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中以5×107/ml进行限制贴壁、旋转培养12h，制备球形聚集体肝细胞循环液。

　　1.2.2 急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)犬模型的制作 中国杂种犬5只，体重10～15kg，雌雄不限, 由南通大学实验动物中心提供。采用门腔静脉端-侧分流及胆总管结扎切断术建模[3]。

　　1.2.3 新型BAL的构建和体内外循环灌流 采用BIOLIV A3A中空纤维管生物反应器构建新型BAL[4]。中空纤维管膜孔径200nm，截流分子质量为70kD。新型BAL由闭合循环的细胞环路和血路两部分组成。细胞环路容量为250ml。将旋转培养后的猪肝细胞悬液(含1×1010猪肝细胞)置于中空纤维管外腔，循环速度20ml/min，持续通入氧气流量2L/min。体外循环灌流时血路采用RPMI1640培养基250ml流经中空纤维管内腔进行循环。体内灌流时，将ALF犬的股动脉血通过BAL的中空纤维管内腔循环到犬股静脉内，循环速度30ml/min。保持生物反应器于37.5℃，循环时间6h。体内外循环灌流实验分别进行5次。

　　1.2.4 检测指标 ①灌流前取球体培养的中国实验用小型猪肝细胞，用PCR扩增检测肝细胞PERV原病毒DNA和猪线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)。②循环前后分别取中空纤维管内腔RPMI1640培养基和犬血清，用RT-PCR扩增检测PERV RNA。

　　1.2.5 引物设计 引物设计参照Switzer文献报告[6]，由上海生工生物工程有限公司合成。针对PERV gag基因序列，上游引物PRETR1：5′-CAGTTCCTTGCCCAGTGTCCTCTT-3′，下游引物PRETR2：5′-CGGCAAGAGAAGAATTTGACTAAGATC-3′，扩增的目的片段大小为187 bp。针对mtDNA序列，上游引物PMTF：5′-TCACCCATCATAGAAGAACTCCTACA-3′，下游引物PMTR：5′-TTTTACGGTTAAGGCTGG GTTATTAAT T-3′，扩增的目的片段大小为255 bp。

　　1.2.6 猪肝细胞DNA和灌流前后中空纤维管内腔循环液、犬血清中RNA的提取 DNA提取：按1 ml消化缓冲液﹕108个细胞的比例加入消化缓冲液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，25mmol/L EDTA(pH 8.0)，5g/L SDS，0.1mg/ml蛋白酶K)。50℃保温18h，其间经常振摇。加入等体积酚/氯仿/异戊醇，混匀、振摇、离心(5000g，10min，室温)。有机相弃去，向水相加入1/2体积7.5mol/L醋酸铵和2体积预冷无水乙醇。离心(5000g，5min，室温)弃上清液。沉淀用70%乙醇洗涤1次，空气中晾干，溶于TE中[5]。

　　RNA提取：按照TaKaPa公司的Cartrimox-14TM RNA提取试剂盒的说明提取RNA，乙醇沉淀，干燥后溶于DEPC处理的dH2O中。

　　1.2.7 PCR和RT-PCR扩增反应 PCR扩增：50μl反应体系中，各1μl引物PRETR1、PRETR2(各20μmol/L)，1μl模板，5μl PCR缓冲液，3μl MgCl2 (25mmol/L)，4μl dNTPs(各2.5mmol/L)，0.25μl Taq聚合酶(5U/μl )，加灭菌ddH2O至终体积50μl。按标准的PCR反应条件：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 11min进行35个循环。然后72℃延伸10min，于1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时其他条件不变，将引物改为PMTF、PMTR各1μl，PCR扩增猪mtDNA，1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　RT-PCR扩增：20μl反应体系中，4μl MgCl2，2μl PCR 缓冲液，8.5μl无RNA酶的ddH2O，2μl dNTPs+(各10mmol/L)，0.5μl RNA酶抑制剂，1μl PRETR2，

　　1μl RNA模板，1μl逆转录酶(RT)。42℃反应20min后，99℃ 5min。再向反应体系中加入6μl MgCl2，64.5μl灭菌蒸馏水，8μl PCR 缓冲液，1μl PRETR1，0.5μl Taq酶。与PCR循环的条件相同进行PCR扩增。同时以无逆转录酶的PCR作对照。

　　2 结 果

　　2.1 PCR扩增 图1显示了循环前猪肝细胞中PERV gag基因和mtDNA PCR扩增产物的凝胶电泳结果。结果表明，在用于BAL循环的5只中国实验用小型猪细胞中均可检测到PERV原病毒DNA和猪mtDNA。

　　2.2 RT-PCR扩增 图2显示了体外灌流前后中空纤维管内腔灌流液和治疗前后犬血清PERV RNA RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。结果表明，所有体外灌流前后中空纤维管内腔灌流液和治疗前后犬血清标本PERV RNA均为阴性。

　　3 讨 论

　　肝衰竭的治疗是临床最为棘手的问题之一。迄今为止，肝移植是惟一有效的治疗手段。但因患者病情危急、供体缺乏和费用较高等原因，肝移植尚不能作为常规治疗手段。人工肝通过有效的体外肝支持作用，有可能为肝衰竭患者过渡到肝移植或经过肝再生而恢复创造条件。近年来，BAL成为人工肝研究的重点[1]。用培养肝细胞发挥生物合成与解毒作用是BAL与非生物人工肝、中间型人工肝的主要区别。在肝细胞来源方面，人肝细胞最为理想，但其来源缺乏;动物肝细胞中，猪肝细胞来源较广，功能与人相近，因此有可能成为异种肝细胞的较合适来源。1997年Patience等[7]首次报道猪体内存在PERV并感染体外培养人细胞系，猪肝细胞在BAL中使用的生物安全性引起人们广泛关注。PERV是单链RNA病毒，几乎存在于所有猪的品系中。Van der Laan等[8]报道了在SCID小鼠进行胰岛细胞异种移植后有少量的PERV感染。这引起人们对种族间PERV传播的普遍担心。本研究对使用猪肝细胞的新型BAL治疗前后进行PERV监测，以期阐明PERV传播的可能性，对猪肝细胞生物人工肝应用的安全性进行探讨。

　　PERV的检测方法包括分子生物学方法和免疫学方法。前者检测PERV原病毒DNA序列、mRNA表达或RT活性，后者通过特异性抗体来检测PERV，包括Western和ELISA。本研究依据高度保守的PERV gag基因序列，选用特异性引物，建立了猪肝细胞PERV原病毒DNA检测的PCR方法和犬血清、肝细胞循环液PERV RNA检测的RT-PCR方法。本研究发现用于BAL的猪肝细胞PERV和猪特异性mtDNA检测结果为阳性，证明中国实验用小型猪肝细胞携带PERV。本研究中采用的新型BAL其生物反应器的中空纤维管截流分子质量为70kD，灌流前后中空纤维管内腔灌流液和犬血清PERV检测结果均为阴性，提示新型BAL治疗6h后猪肝细胞携带的PERV可能尚未释放或病毒浓度较低或病毒不能通过BAL的中空纤维管，因而RT-PCR方法未能检测出来。初步研究表明猪肝细胞为基础的新型BAL应用未发现PERV的传播。

　　【参考文献】

　　[1] Mareels G, Poyck PP, Eloot S, et al. Three-dimensional Numerical Modeling and Computational Fluid Dynamics Simulations to Analyze and Improve Oxygen Availability in the AMC Bioartificial Liver[J]. Ann Biomed Eng, 2006,34(11):1729-1744.

　　[2] Chen Z, Ding Y, Zhang H. Morphology, viability and functions of suckling pig hepatocytes cultured in serum-free medium at high density[J]. Dig Surg, 2002,19(3):184-193.

　　[3] 陈 钟, 丁义涛, 徐庆祥, 等. 犬急性肝衰竭一种新模型的建立[J]. 中国普通外科杂志, 2003,12(3):206-208.

　　[4] Chen Z, Ding Y. Configuration of a new bioartificial liver support system and in vitro evaluation of its functions[J]. Ann Clin Lab Sci, 2005,35(1):7-14.

　　[5] 田鹏鹏, 陈 钟, 黄 华, 等. 猪肝细胞和培养上清中猪内源性逆转录病毒的检测[J]. 细胞生物学杂志, 2004,26(5):544-547.

　　[6] Switzer WM, Shanmugam V, Chapman L, et al Polymerase chain reaction assays for the diagnosis of infection with the porcine endogenous retrovirus and the detection of pig cells in human and nonhuman recipients of pig xenografts[J].Transplantation, 1999,68(2):183-188.

　　[7] Patience C, Takeuchi Y, Weiss R A. Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs[J]. Nat Med, 1997, 3 (3):282-286.

　　[8] Van der laan LJW, Lockey C, Griffeth BC, et al. Infection by porcine endogenous retrovirus after islet xenotransplantation in SCID mice[J]. Nature,2000,407(6800):90-94.