MAGE-3 在胃癌组织中的表达及其临床意义

　　作者：何宋兵　汪良　吴雨岗　陈彦　孙康　张雁云 作者单位：1苏州大学附属第一医院　普外科　(江苏　苏州　215006) 2常州市第一人民医院　普外科　(江苏　常州　213003) 3上海交通大学医学院　上海市免疫学研究所　(上海　200025)

　　【摘要】目的: 检测黑色素瘤抗原基因-3 (MAGE-3) 在胃癌组织中的表达，探讨其在胃癌免疫治疗中的应用价值。方法: 应用 RT-PCR方法对 40 例胃癌组织和相应的癌旁组织以及 20 例胃慢性炎症组织中的 MAGE-3 基因进行检测，随机选取 RT-PCR 阳性扩增产物进行测序，并结合临床病理参数进行研究分析。结果: 在 40 例胃癌组织中，MAGE-3 基因的表达阳性率为 67.5% (27/40)，明显高于在相应的癌旁组织 15% (6/40)及胃慢性炎症组织中的表达阳性率 10 % (2/20)。DNA 测序证实 RT-PCR 产物确为 MAGE-3 基因的目的片段。胃癌组织中 MAGE-3 基因表达的阳性率与胃癌的浸润深度有关，而与病理分期、分化程度和淋巴转移无 关。结论: MAGE-3 基因在胃癌组织中有较高的表达率，可望将其编码的蛋白作为靶分子应用于胃癌的免疫治疗。

　　【关键词】 胃肿瘤· 黑色素瘤抗原基因-3

　　Expression of melanoma antigen gene-3(MAGE-3) in gastric neoplasm and its clinical significance

　　HE Song-bing1, WANG Liang1, WU Yu-gang2, CHEN Yan2, SUN Kang1, ZHANG Yan-yun3

　　1Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Suzhou University (Suzhou 215006, China)

　　2Department of General Surgery, the First People's Hospital of Changzhou (Changzhou 213003, China)

　　3Shanghai Institute of Immunology, Medical College of Shanghai Jiao Tong University (Shanghai 200025, China)

　　【ABSTRACT】 Objectives: To detect the expression of melanoma antigen-3(MAGE-3) in human stomach neoplasms and explore the possibility of applying the antigen as target for immunotherapy of stomach neoplasms. Methods: Expression of MAGE-3 gene in 40 stomach neoplasms, para-tumorous mucosa, and 20 samples of chronic gastritis were examined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The samples selected randomly from each gene with positive PCR were confirmed by DNA sequence analysis. Results: In 40 stomach neoplasms, MAGE-3 gene was expressed in 27 tumor tissues (67.5%). The positive rates of MAGE-3 gene expression in neoplasm tissues were significant higher than those of para-tumorous mucosa (15%) and 20 samples of chronic gastritis (10%). The DNA sequence confirmed that the RT-PCR products was truly target cDNA. The expression of MAGE-3 gene in stomach neoplasm tissues was relevant to the intruded depth of neoplasm cells (P<0.05), but not relevant to pathological staging, the differentiatation degree of neoplasm cells and lymph node metastasis (P>0.05). Conclusion: MAGE-3 gene is expressed in stomach neoplasm at a high frequency, which suggests the possibility of using them as targets for antigen-specific immunotherapy.

　　【KEY WORDS】 Stomach neoplasms · Melanoma antigen gene-3 · Gene expression

　　胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其病因复杂、异质性高、预后差，目前尚未发现其特异性较高的肿瘤相关抗原。黑色素瘤抗原基因 (Melanoma antigen gene，MAGE) 首先发现于黑色素瘤[1]， 近年来研究表明其在其他恶性肿瘤中也有较高表达，但在正常组织只表达于睾丸[2-4]，其特异性表达的特点引起人们很大的关注。为探讨MAGE 基因在胃癌的临床应用价值，2004年～2006年，我们对胃癌组织中MAGE-3 基因的表达进行了检测，并分析其与临床病理之间的关系，以期为胃癌的免疫治疗寻找合适的靶位并提供理论依据。

　　1　资料与方法

　　1.1　临床资料　40 例胃癌和相应的癌旁组织标本来自 2004 年 6 月～2005 年 6 月本院普外科经手术治疗的患者，均经病理学证实。40 例胃癌患者中男28 例，女 12 例;平均年龄 58.7 岁 (36～77 岁)。另取20 例慢性胃炎患者的活检组织(由本院胃镜室提供)作为对照研究。

　　1.2　主要试剂　黑色素瘤 A375 细胞株(作为表达 MAGE-3 基因的阳性对照)， 购于中科院上海生物细胞所。TRIzol 试剂购于 Invitrogen 公司，SuperScript cDNA第一链合成剂购于Promega 公司，凝胶图象分析仪 GelDoc-2000为BD Clontech公司产品，紫外光光度仪 DU800为 Beckman 公司产品。

　　1.3　检测方法　取 -80℃ 冻存的组织标本 50～100 mg ， 加 TRIzol 1ml 裂解，经三氯甲烷分层、异丙醇沉淀及乙醇洗涤干燥后，将所得 RNA 溶于无 RNA 酶的纯水中，用紫外光光度计对其定量。取总 RNA 2.5 μg ，加入 Oligo (dT) 15 ( Promega) 及 Superscript Ⅱ 逆转录酶( Introvigen) ，按说明书要求合成 cDNA。取稀释 5 倍后的 cDNA 5μl ，加入 10 μm 的外引物各 1.5μl ，1μl 10mmol/L 的 dNTPs 及 2.5 UTaq 多聚酶(GIBCO公司)以及 PCR 缓冲液等组成共 50 μl 的反应体系。反应在实时 PCR 仪 (ABI 7900HT, Applied Biosystems, USA) 中进行。扩增β-action 作为内参照。用于 PCR 的特异性引物参见文献[5](见表 1)。扩增产物用 20 g/L 和 10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳，EB 染色鉴定， 再用凝胶图像分析仪扫描电泳图像。随机选择目的基因呈阳性表达的 RT-PCR 产物进行 DNA 测序(上海生工生物技术有限公司)。

　　1.4　统计学处理　采用 SSPS11.0 统计软件对数据进行χ2检验。P < 0.05 为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　MAGE-3 基因在各组织中的表达　在检测的 40 例胃癌组织中，MAGE-3 基因表达的阳性率为 67.5% (27/40)，在癌旁组织中表达的阳性率为 15% (6/40)，在 20 例胃慢性炎症组织中表达的阳性率为 10% (2/20)。 MAGE-3 基因在胃癌组织 的阳性表达率明显高于癌旁组织和胃慢性炎症组织(P< 0.01)。详见图 1。

　　2.2　MAGE-3 基因扩增产物的 DNA 测序　测序结果表明 RT-PCR 产物与从 GenBank 上检索的 MAGE-3(NM 004988) 扩增范围序列基本一致，证实所得到的 cDNA 确为要扩增的目的片段。

　　2.3 MAGE-3 基因的表达与胃癌临床病理关系　MAGE-3 基因在胃癌组织中的表达结合临床病理参数进行分析(见表 2)，与胃癌的浸润深度有关 (P < 0.01);而与胃癌的病理分期、分化程度和淋巴结转移无关(P > 0.05)。

　　3　讨论

　　MAGE 基因是应用免疫学和分子生物学技术发现的一类肿瘤特异性抗原，在 MAGE 基因家族众多成员中，MAGE-1 和 MAGE-3 基因含有多个 CD8+T 细胞识别表位[6,7]，后者还含有多个 CD4+T 细胞识别表位[8]，并且两者含有频率很高的 HLA 基因的限制性表位。肿瘤细胞表达肿瘤特异性抗原是诱导抗肿瘤特异性免疫应答的前提[9]，基于 MAGE 基因的特异性表达，国外已有学者将其应用于黑色素瘤等一些恶性肿瘤的免疫治疗。

　　关于 MAGE 基因在胃癌组织中表达的研究相对较少。Akiyoshi T等[10]对57 例胃癌标本的研究发现，MAGE-1或MAGE-3基因的表达率分别为 44 % 和41%，61%的肿瘤组织至少表达一种 MAGE 基因，而癌旁正常组织均呈阴性表达。同时对胃癌细胞株研究发现，73 % 表达 MAGE-1 或 MAGE-3 基因。Okada等[11]检测了胃癌患者淋巴结中 MAGE-3、CEA 和 CK20 基因的表达，其中任一基因表达阳性，均提示有肿瘤复发的可能，为胃癌患者局部区域淋巴结微转移的检测提供了有效手段。本研究应用 RT-PCR 技术对40 例胃癌组织及其相应的癌旁组织标本以及20 例慢性胃炎患者的活检组织，进行了 MAGE-3 基因的检测。结果显示 MAGE-3 基因在 40 例胃癌组织中表达的阳性率为 67.5 % (27/40)，明显高于在相应的癌旁组织及胃慢性炎症组织中的表达。表明 MAGE-3 基因在胃癌组织中有较高特异性的表达，这为将其应用于胃癌患者的特异性免疫治疗提供了理论依据。

　　关于 MAGE 基因表达与恶性肿瘤发生、发展的关系，目前仍存在不少争议。多数研究表明 MAGE 基因的表达与恶性肿瘤的临床分期、转移及复发密切相关。Katano等[12研究发现 MAGE-3 基因的表达与胃癌的发展和转移有关，即分期越晚，肿瘤浸润越深，基因表达率就越高;而与肿瘤大小及组织学分型无关。Gillespie 等[7]发现 MAGE-3 基因能表达于一系列子宫内膜癌的癌前病变，认为 MAGE 基因的表达是肿瘤形成过程中的一个早期事件。本实验对胃癌组织中 MAGE-3 基因的表达与其临床病理参数的关系进行研究发现， MAGE-3 基因表达的阳性率与胃癌的浸润深度有关，而与病理分期、分化程度和淋巴结转移无显著相关性。值得注意的是， MAGE-3 基因在本组癌旁组织和胃慢性炎症组织中也有一定的表达，笔者认为这些组织可能并非完全正常，是否属于癌旁移行黏膜或处于癌前状态，尚需进一步研究证实。

　　总之，本研究发现 MAGE-3 基因在胃癌中有较高的表达，并与胃癌的浸润深度有关，有望可以作为评估胃癌生物学行为和判断预后的生物学指标， 为将其编码的产物作为靶分子并应用于胃癌的抗原特异性免疫治疗提供了理论依据。

　　【参考文献】

　　[1] Vander Bruggen P, Traversari C, Chomez P, et al. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma[J]. Science, 1991,254(5038):1643-1647.

　　[2] Ohman Forslund K, Nordqvist K. The melanoma antigen genes--any clues to their functions in normal tissues?[J]. Exp Cell Res, 2001, 265(2):185-194.

　　[3] Odunsi K, Jungbluth AA, Stockert E, et al. NY-ESO-1 and LAGE-1 cancer-testis antigens are potential targets for immunotherapy in epithelial ovarian cancer[J]. Cancer Res, 2003,63(18): 6076-6083.

　　[4] Inoue H, Mori M, Li J, et al. Human esophageal carcinomas frequently express the tumor-rejection antigens of MAGE genes[J]. Int J Cancer, 1995,63(4):523-526.

　　[5] Mashino K, Sadanaga N, Tanaka F, et al. Expression of multiple cancer-testis antigen genes in gastrointestinal and breast carcinomas[J]. Br J Cancer, 2001,85(5):713-720.

　　[6] Chaux P, Luiten R, Demotte N, et al. Identification of five MAGE-A1 epitopes recognized by cytolytic T lymphocytes obtained by in vitro stimulation with dendritic cells transduced with MAGE-A1[J]. J Immunol, 1999,163(5):2928-2936.

　　[7] Gillespie AM, Coleman RE. The potential of melanoma antigen expression in cancer therap[J]. Cancer Treat Rev, 1999,25(4):219-227.

　　[8] Chaux P, Vantomme, Stroobant V, et al. Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes[J]. J Exp Med, 1999,189(5):767-778.

　　[9] Rosenberg SA. Progress in human tumour immunology and immunotherapy[J]. Nature, 2001,411(6835):380-384.

　　[10] Li J, Yang Y, Fujie T, et al. Expression of BAGE, GAGE, and MAGE genes in human gastric carcinom[J]. Clin Cancer Res, 1996, 2(9):1619-1625.

　　[11] Okada Y, Fujiwara Y, Yamamoto H, et al. Genetic detection of lymph node micrometastases in patients with gastric carcinoma by multiple-marker reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay[J]. Cancer, 2001,92(8):2056-2064.

　　[12] Katano M, Nakamura M, Morisaki T, et al. Melanoma antigen-encoding gene-1 expression in invasive gastric carcinoma: correlation with stage of disease[J]. J Surg Oncol, 1997,64(3):195-201.