肝细胞癌组织中Skp2的表达及与p27kip1、PCNA蛋白表达的关系
发表时间：2010-10-21 浏览次数：419次
作者：程阳，王酉，陈莉，陆牡丹，秦军，崔小鹏，李鹏，刘胜利 作者单位：南京港口医院普外科，南京 210011
【摘要】 目的：探讨Skp2的表达在肝细胞癌(HCC)发生发展中的作用，及其与p27kip1(p27)和PCNA的关系。方法：收集76例HCC及癌旁组织，l0例肝血管瘤旁肝组织的临床病理档案资料，l0例HCC及癌旁肝新鲜组织，采用免疫组织化学方法及免疫印迹技术检测Skp2、p27及PCNA蛋白在这些组织中的表达。结果：免疫印迹结果显示：Skp2在HCC组织中的表达明显高于对应的癌旁肝组织。免疫组织化学结果显示HCC中Skp2的阳性率(24.08%)显著高于癌旁组织和正常肝组织(P<0.001)。Skp2的表达与肝癌组织分化程度，血清AFP值及转移有关(P<0.05)。p27在正常肝组织和癌旁组织中的表达明显高于HCC组织(P<0.001)。HCC组织中PCNA蛋白的表达明显高于癌旁和正常组织(P<0.01)。HCC组织中Skp2的表达与p27呈负相关(P<0.001);与PCNA呈正相关(P<0.01)。结论：Skp2在HCC组织中表达是上调的，可能是通过作用于细胞周期调控蛋白p27，加速了对p27泛素化依赖的蛋白降解，使其表达及代谢发生异常。导致细胞周期失控并促进细胞异常增殖，从而参与了HCC的发生和发展。
【关键词】 肝细胞癌;免疫印迹法;免疫组织化学;增殖细胞核抗原;Skp2;P27
Expression of Skp2 in hepatocellular carcinoma and its relationship
with p27kip1 and PCNA protein expressions
1CHEN Yang, 3WANG You, 3CHEN Li, et al (1Department of General Surgery, Gang Kou Hospital, Nanjing 210011; 2Department of General Surgery, Zhong Da Hospital, Southeast University; 3Department of Pathology, Nantong University; 4 the Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001)
[Abstract] Objective: To investigate the expression of Skp2 and its relationship with expressions of p27 and PCNA proteins in human hepatocellular carcinoma(HCC). Methods: Immunohistochemical study for Skp2，p27, PCNA was performed on 10 cases of native liver tissue adjacent to hepatic hemangioma and in 76 cases of hepatocellular carcinoma tissues and adjacent nontumorous tissues. Fresh specimens from 10 cases of HCC and the adjacent liver tissue were also collected for Western blot analysis. Results: Western blot analysis showed that Skp2 expressions in HCC was higher than those in adjacent liver tissue. Immunohistochemistry of 76 HCCs showed marked increase in Skp2 and PCNA expressions but not p27, in HCC compared with noncancer tissues. Skp2 expression in HCC correlated with histological differentiation, serum alpha-fetal protein levels and metastasis (P<0.05). In HCC, inverse correlation was found between Skp2 and p27(P<0.01) and a positive correlation was found between Skp2 and PCNA(P<0.01). Conclusions: Expression of Skp2 is up-regulated significantly in HCC compared with adjacent liver tissue and normal liver tissues，and overexpression of Skp2 reduces the protein level of p27 through ubiquitin-dependent degradation and causes disruption of cell cycle control and enhancement of the proliferative activity, indicating Skp2 playes an important role in oncogenesis and development of HCC.
[Key words] Hepatocellular carcinoma;Immunoblotting;Immunohistochemistry;Proliferating cell nuclear antigen;Skp2;P27
肿瘤既是一类基因疾病，也是一类细胞周期疾病。几乎所有癌基因的功能效应最终都要汇聚到细胞周期机制上来。细胞S期激酶相关蛋白-2(S-phase kinase- associated protein 2，Skp2)是SCF泛素连接酶复合体的特异底物识别亚单位F-box蛋白家族的成员之一，能特异性地作用于磷酸化细胞周期负性调控因子p27，使其通过泛素-蛋白酶体途径降解，导致细胞周期调节失控。近年来研究发现，Skp2在多种肿瘤组织中表达均增高，而p27表达减少,从而推断Skp2表达及功能的异常有可能经由细胞周期相关蛋白的泛素化依赖的蛋白水解途径，参与了肿瘤的发生发展[1~4]。肝癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，其中约55%发生在中国[5]，但有关Skp2及p27和PCNA在肝癌组织中，尤其是新鲜组织中的表达以及与肝癌生物学特征的相关性研究较少。我们用免疫印迹和免疫组化方法检测HCC组织中Skp2、 p27和PCNA三种蛋白的表达，旨在探讨三者的相关性及与临床病理特征的联系。
1 材料与方法
1.1 组织标本及病例 收集南通大学附属医院肝癌手术切除的10对新鲜HCC组织及对应的癌旁肝组织，用于提取蛋白。收集南通大学附属医院及市医院有病理资料76例HCC石蜡标本用于免疫组化及临床病理统计。其中HCC采用WHO的最新组织学分级和临床分期标准[6]。另收集南通大学附属医院10例肝血管瘤旁正常肝组织做对照。
1.2 主要试剂 兔抗人p27kip1多克隆抗体p27：sc-528，兔抗人Skp2p45：sc-7164(santacruz公司)。鼠抗人p27kip1单抗(NeoMarkers公司)。鼠抗人PCNA单抗、柠檬酸抗原修复液及DAB显色剂(北京中山生物技术有限公司)。鼠抗人Skp2(zymed公司)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG、β-actin单抗(Sigma公司)。二步法免疫组化检测试剂盒(GBI公司)。
1.3 方法
1.3.1 蛋白质免疫印迹检测 选择其中6对HCC组织及癌旁组织，匀浆提取组织蛋白。全自动蛋白质核酸定量仪测定蛋白含量，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，蛋白上样量40μg，转移槽转移到PVDF膜。室温封闭2h。一抗[p27kip1(c-19) 1∶500, Skp2(H-435) 1∶500，PCNA 1∶1000, β-actin 1∶3000]4℃过液，HRP偶联的二抗(1∶1000)室温2h，ECL显色。
1.3.2 免疫组化染色和判定标准 操作步骤按免疫组化试剂盒说明进行。用已知的乳腺癌阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。DAB显色，苏木素复染，明胶甘油封片。光镜下每张切片选取5个有代表性的高倍视野(400×)，每个视野随机计数500个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分率。每个指标的染色结果以其标记指数(Label index，LI)表示，LI=阳性细胞数/细胞计数的总数。
1.3.3 统计学方法 显著性差异采用秩变换检验、方差分析，相关性分析采用χ2检验、Fisher精确概率法及Spearman等级相关分析，全部数据采用Stata 7.0统计分析系统，P< 0.05有统计学意义。
2 结 果
2.1 Western blot 检测Skp2、p27及PCNA在肝癌及癌旁组织中的表达 免疫印迹结果显示：Skp2及PCNA在HCC中的表达均明显高于对应癌旁肝组织(图1)。6对HCC组织及对应癌旁组织中除第2对外，HCC组织中p27的表达低于癌旁组织(图1)。
2.2 免疫组化检测Skp2、p27及PCNA在肝癌及癌旁和血管瘤旁肝组织中的表达 免疫组化结果显示：Skp2，PCNA在HCC中高表达，主要表达在细胞核。HCC中Skp2 LI为24.07%，PCNA LI为42.31%;癌旁组织和肝血管瘤旁正常肝组织中Skp2 LI分别2.87%和1.81%，PCNA LI为3.11%和2.01%。p27的表达与Skp2和PCNA相反，主要在癌旁组织和正常肝组织中高表达，主要表达在胞核;其中有6例p27在HCC中高表达，且胞浆和胞核都有表达。HCC、癌旁和肝血管瘤旁正常肝组织中p27 LI分别为26.50%、76.20%和73.58%((图2, 表1)。Skp2、p27、PCNA在HCC中的表达与癌旁组织和血管瘤旁肝组织相比有显著的统计学意义(P<0.01)(表1)。
2.3 Skp2、p27及PCNA蛋白的表达与HCC临床病理特征的关系 以Skp2、p27及PCNA在HCC中LI的平均值(分别为0.24，0.26，0.42)为界，将其分为高表达组和低表达组，分析Skp2、p27及PCNA的表达与临床病理特征之间的关系。Skp2的表达强度与患者血清AFP水平、肿瘤病理分级以及转移相关，P值分别为0.026，0.029，0.002，与患者的性别、年龄、肿瘤直径、血清HBsAg及是否伴有坏死和肝硬化无关。p27与PCNA在HCC中的表达均与AFP水平、肿瘤病理分级、转移和坏死有关，P值分别为0.029， 0.000，0.001，0.003和0.016，0.001，0.001，0.005，与其它病理学特征无关(表2)。
2.4 p27、Skp2及PCNA表达的相关性 通过对HCC中Skp2、PCNA和p27蛋白表达的相关性分析，我们发现Skp2蛋白与p27蛋白的表达呈明显负相关(r=-0.618，P<0.01)，Skp2蛋白和PCNA蛋白的表达呈正相关(r=0.619，P<0.01)。p27蛋白和PCNA蛋白的表达呈负相关(r=-0.765，P<0.01)
3 讨 论
细胞周期调控机制的紊乱，特别是G1-S期转变过程中调节失控，是细胞发生恶性转化的重要分子事件之一。Skp2作为SCF复合体的底物识别亚基，能特异性识别磷酸化的底物并介导其泛素化降解，许多细胞周期调控因子都是泛素蛋白酶体途径的底物[7]，其中p27是SCFSkp2泛素化和随后蛋白降解的主要靶分子之一。研究发现，在人类一些恶性肿瘤如胃癌 、肾细胞癌、皮肤鳞癌[3~5]中Skp2表达显著增加，因此Skp2在恶性肿瘤中的表达增高及其生物学行为使之有可能成为肿瘤治疗的靶点。有关Skp2在HCC中,尤其是肝癌新鲜组织中表达的研究尚不多。在我们的研究中，免疫印迹结果显示Skp2在HCC组织中的表达明显高于对应的癌旁肝组织，免疫组织化学结果也显示Skp2在HCC中表达显著高于癌旁肝组织及血管瘤旁肝组织。我们还比较Skp2在HCC中的表达强度与患者的临床病理因素的关系，结果表明：Skp2的表达强度与患者血清AFP水平、肿瘤病理分级以及是否有转移之间差异有统计学意义(P<0.05)。这一系列结果提示Skp2可能在HCC的发生发展过程中发挥重要的作用。
p27是公认的细胞周期负性调节蛋白，对G1-S期转换具有显著的抑制作用。p27的降解异常可导致细胞周期紊乱、恶性增殖。我们的研究发现，作为Skp2依赖性泛素蛋白酶体途径降解的主要底物蛋白，p27和Skp2之间呈负相关，表明p27在HCC组织中表达降低与Skp2过表达有关，同时两者的表达异常与HCC的生物学特性相关，提示Skp2是通过泛素蛋白酶体途径影响细胞周期蛋白p27的表达及代谢，导致细胞周期失控，促进肿瘤发生和发展。然而，我们研究的76例HCC中有6例(7.9%,均为中低分化HCC)Skp2与p27蛋白均为高表达，并且在这6例中p27在胞浆胞核均有阳性信号表达，说明除了Skp2介导p27的泛素化降解外，还有其他机制可能也参与了p27表达的调控，可能与p27的胞浆定位及其出核转运相关[8~12]。
PCNA为增殖细胞核抗原，是G1/S期DNA复制的基本因子DNA聚合酶辅助蛋白，多用于检测肿瘤细胞增殖活性，并已在临床病理中应用。但它在HCC中的表达是否与分化程度相关有不同的报道[13,14]。我们的研究发现，Skp2的表达与PCNA之间呈正相关，表明Skp2表达异常可能与细胞的异常增殖有关，两者协同参与了HCC的发生发展。
综上所述，Skp2在肝癌组织中表达是上调的，可能通过特异性的作用于磷酸化的p27，加速了对p27泛素化依赖的蛋白降解，使其表达及代谢发生异常，导致细胞周期失控并促进细胞异常增殖，从而参与了HCC的发生和发展。进一步研究泛素蛋白酶体通路的调控紊乱可为临床肝癌的诊治提供新的思路。
【参考文献】
[1] Tsvetkov LM, Yeh KH, Lee SJ, et al. P27(Kip1) ubiquitination and degradation is regulated by the SCF(Skp2) complex through phosphorylated Thr187 in p27[J]. Curr Biol, 1999, 9(12): 661-664.
[2] Masuda TA, Inoue H, Sonoda H, et a1. Clinica1 and biological significance of s- phase kinase-associated protein 2(skp2)gene expression in gastric carcinoma: modulation of malignant phenotype by skp2 overexpression possible via p27 proteolysis[J]. Cancer Res, 2002, 62(13): 3819-3825.
[3] Langner C, Von WR, Ratschek M, et a1. Biological significance of p27 and Skp2 expression in renal cell carcinoma. A systematic analysis of primary and metastatic tumour tissues using a tissue microarray technique[J].Virchows Arch, 2004, 445(6): 631-636.
[4] Fernandez MT, Puig L, Musulen E, et a1. Prognostic significance of p27kip1, p45Skp2 and Ki67 expression profiles in Merkel cell carcinoma, extracutaneous small cell carcinoma, and cutaneous squamous cell carcinoma[J]. Histopathology, 2005, 46(6): 614-621.
[5] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et a1. Global cancer statistics, 2002[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2): 74-108.
[6] Marrero JA, Fontana RJ, Barrat A, et a1. Prognosis of hepatocellular carcinoma: comparison of 7 staging systems in an American cohort[J]. Hepatology, 2005, 41(4): 707-716.
[7] Ganoth D, Bornstein G, Ko TK, et al. The cell-cycle regulatory protein CKs1 is required for SCF(Skp2)-mediated ubiquitinylation of p27[J]. Nat Cell Biol, 2001, 3 (3): 321-324.
[8] Bondar T, Kalinina A, Khair L,et al. Cul4A and DDB1 associate with Skp2 to target p27Kip1 for proteolysis involving the COP9 signalosome[J]. Mol Cell Biol, 2006, 26(7): 2531-2539.
[9] Alkarain A, Slingerland J. Deregulation of p27 by oncogenic signaling and its prognostic significance in breast cancer[J]. Breast Cancer Res, 2004, 6(1): 13-21.
[10] Yu J，Zhang HY，Ma ZZ，et a1.Methylation profiling of twenty four genes and the concordant methylation behaviours of nineteen genes that may contribute to hepato-cellular carcinogenesis[J].Cell Res, 2003, 13(5):319-333.
[11] Fukumoto A，Ikeda N，Sho M，et a1.Prognostic significance of localized p27Kipl and potential role of Jabl/CSN5 in pancreatic cancer[J].Oncol Rep, 2004, 11(2): 277- 284.
[12] Shin I, Rotty J, Wu FY, et al. Phosphorylation of p27Kip1 at Thr-157 interferes with its association with importin alpha during G1 and prevents nuclear re-entry[J]. J Biol Chem, 2005, 280(7): 6055-6063.
[13] Tannapfel A, Geissler F, Kockerling F, et a1. Apoptosis and proliferation in relation to histopathological variables and prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. J Pathol, 1999, 187(4): 439-445.
[14] Ng IO, Lai EC, Fan ST, et a1. Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer, 1994, 73(9): 2268-2274.
