红景天甙对帕金森病模型小鼠PI3K/蛋白激酶B信号转导途径的影响

红景天甙对帕金森病模型小鼠PI3K/蛋白激酶B信号转导途径的影响作者：张宇红，叶民，汪锡金，王刚，杨红旗，马建芳，王志全，陈生弟    作者单位：200025上海交通大学医学院附属瑞金医院神经科，帕金森病诊疗与研究中心（叶民现在南京脑科医院）    【摘要】  　　目的 研究红景天甙对帕金森病（PD）小鼠脑组织中PI3K/蛋白激酶B（PKB）信号转导途径的影响及其神经保护作用的机制。方法 30只C57BL雄性小鼠随机分为PD组、红景天甙组和正常对照组，每组10只。用蛋白印迹法检测小鼠纹状体中Akt/pAkt（ser 473）及其下游糖原合成酶激酶3β（GSK3β）/磷酸化糖原合成酶激酶3β［pGSK3β（ser 9）］、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）、BAD和Bcl2的表达。结果 红景天甙组及正常对照组纹状体pAkt（ser 473）表达（0.5487±0.01376，0.5055±0.0524）比PD组（0.3069±0.08734）显著增高（均P<0.05）；pGSK3β（ser 9）蛋白表达（0.6959±0.3327）较PD组（0.4884±0.02257）显著增高（P<0.05）。红景天甙组的Bcl2/BAD比值（1.2669±0.231）明显高于PD组（0.4583±0.088）（P<0.05）。红景天甙组小鼠纹状体中活化的Caspase3 蛋白（0.0874±0.0109）比PD组（0.1409±0.089）明显下降（P<0.05）。结论 红景天甙能使PI3K/PKB信号转导途径中Akt在ser 473位点以及GSK3β在ser 9位点的磷酸化程度增高、上调Bcl2/BAD比值、抑制Caspase3蛋白的活化，发挥神经保护作用。    【关键词】  红景天甙 帕金森病 PI3K 蛋白激酶B　　Effect of Salidroside on PI3K/protein kinase B signaling in Parkinsons disease model mice  ZHANG Yuhong, YE Min，WANG Xijin，et al. Department of Neurology, Clinical & Research Center for Parkinson Disease, Ruijin Hospital, the Medical School of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China    Abstract：Objective  To investigate the effect of Salidroside on PI3K/protein kinase B(PKB) signaling in Parkinsons disease（PD） model mice and its mechanism of neuroprotection.Methods  The 30 C57BL mice were divided into 3 groups: PD group(10), Salidroside group(10) and  normal control(NC) group(10).The protein expressions of Akt, pAkt(ser 473), GSK3β, pGSK3β(ser 9), Bcl2, BAD and Caspase3 were detected by Western blot.Results  The protein levels of pAkt(ser 473) in striatum were significantly increased in Salidroside group（0.5487±0.01376）and NC group(0.5055±0.0524) than that in PD group（0.3069±0.08734） (allP<0.05). The expression of pGSK3β (ser 9) protein was obviously increased in Salidroside group (0.6959±0.0332) than that in PD group (0.4884±0.0225) (P<0.05). The Bcl2/BAD ratio of Salidroside group (1.2669±0.231) was much more increased than that of PD group (0.4583±0.088)(P<0.05). Expression of active Caspase3 in Salidroside group（0.0874±0.0109） was much lower than that in PD group（0.1409±0.089）(P<0.05).Conclusions  The Salidroside can increase phospholateion activation of Akt at ser 473 site and GSK3β at ser 9 site in PI3K/PKB, can partially increase the Bcl2/BAD ratio and inhibit the activation of Caspase3 protein,therefore it can play neuroprotective effect.     Key words：Salidroside; Parkinsons disease; PI3K; protein kinase Ｂ　　帕金森病（PD）的病理改变以中脑黑质致密部多巴胺（DA）能神经元大量变性、纹状体DA含量显著减少为特征。本课题组以往研究［1］发现,红景天甙具有一定抗黑质神经细胞凋亡的作用。本研究观察红景天甙对PD小鼠 PI3K/蛋白激酶B（PKB）信号途径中Akt蛋白和其下游信号蛋白糖原合成酶激酶（GSK）3β，以及与神经元凋亡相关信号蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）、Bcl2和BAD的影响，以探讨红景天甙神经保护作用的机制。1  材料与方法　　1.1  材料  雄性8周龄健康C57BL小鼠30只（购自上海BK动物实验有限公司），质量19～23 g。随机分为PD模型组（PD组）、红景天甙干预组（红景天甙组）及正常对照组，每组10只。主要试剂：兔抗PKB(AntiAkt) 多克隆抗体、磷酸化的兔抗PKB［AntipAkt（ser 473）位点］多克隆抗体、兔抗GSK3β多克隆抗体以及磷酸化的兔抗GSK3β［AntipGSK3β(ser 9)］多克隆抗体（均购自美国Cellsignal公司）；单克隆抗体Bcl2、BAD 以及Caspase3（购自美国Santa Cruz公司）；BetaActin（美国Sigma公司）；1甲基4苯基1, 2, 3, 6四氢吡啶（MPTP） (美国Sigma公司)；红景天甙（上海绿谷药业提供）。　　1.2  方法　　1.2.1  PD模型制作及处理  PD组：腹腔注射MPTP（30 mg/kg），每天1次，连续7 d，此后腹腔注射生理盐水0.3 ml，每天1次，连续 7 d；红景天甙组：腹腔注射MPTP（30 mg/kg），每天1次，连续7 d，同时腹腔注射红景天甙（50 mg/kg），每天1次，连续14 d。正常对照组：仅腹腔注射生理盐水0.3 ml，每天1次，连续14 d。　　1.2.2  免疫印迹检测  完成药物注射次日，将小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）麻醉后，快速断头取脑，取纹状体组织置-70℃冰箱保存。纹状体组织用PBS洗1次，加入组织蛋白裂解缓冲液500 μl。匀浆离心后，取上清，用二辛可宁酸法测定蛋白含量。取30 μg样本经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDSPAGE)，从凝胶分离蛋白, 转印蛋白至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭，分别加Akt多克隆抗体（按1∶200稀释）、pAkt(ser 473)多克隆抗体（1∶100稀释）、GSK3β多克隆抗体（1∶400稀释）、pGSK3β(ser 9)多克隆抗体（1∶100稀释）、Bcl2单克隆抗体(1∶300)、BAD单克隆抗体(1∶300)、Caspase3单克隆抗体(1∶250)；TBST缓冲液（20 mmol/L TrisHCl, pH 7.4，140 mmol/L NaCl，0.1% Tween20）缓冲液洗5 min×3次。辣根过氧化物酶标记抗兔二抗室温下孵育1 h。洗后，化学发光法显影。　　1.2.3  统计学方法  检测结果用均数±标准差(±s)表示,数据处理用SPSS 10.0软件,3组数据比较采用单因素方差分析。2  结果　　2.1  3组小鼠纹状体Akt及pAkt（ser 473）表达的比较  见表1。3组小鼠脑纹状体中Akt表达的差异无统计学意义（P>0.05）。PD组纹状体中pAkt（ser 473）表达明显低于正常对照组（P<0.01）；红景天甙组pAkt(ser 473)表达比PD组显著增高（P<0.01）。　　2.2  3组小鼠纹状体GSK3β及pGSK3β(ser 9)表达的比较  见表1。3组小鼠脑纹状体中GSK3β表达差异无统计学意义（P>0.05）。PD组纹状体中pGSK3β(ser 9)磷酸化比正常对照组明显降低（P<0.01）；红景天甙组pGSK3β(ser 9)表达比PD组显著增高（P<0.01）。　　2.3  3组小鼠纹状体Bcl2/BAD的比较  见表1。红景天甙组和正常对照组Bcl2/BAD（1.267±0.231，2.947±0.443）显著高于PD组（0.458±0.088）（P<0.05～ 0.01）。　　2.4  3组小鼠纹状体Caspase3和活化Caspase3蛋白表达比较  见表1。红景天甙组和正常对照组Caspase3蛋白及活化Caspase3蛋白表达明显低于PD组（P< 0.05～ 0.01）。　　表1  3组小鼠脑纹状体所检测蛋白表达的比较（略）　　注：与PD组比较△P<0.05，*P<0.013  讨论　　在神经元的发育、生存和功能方面，PI3K/PKB是一条十分重要的信号传导途径［2-5］。而Akt 又是位于此途径上游最重要的调节蛋白之一。Akt的功能涉及细胞营养代谢、细胞存活与生长、细胞凋亡、细胞周期调控等诸多方面。Akt 在3磷酸肌醇及3磷脂肌醇依赖激酶作用下被激活。磷酸化是Akt 激活的主要机制，激活的Akt可以保护细胞存活，减轻损伤，是脑损伤治疗的重要靶分子，具有药物开发与应用价值［6-8］。GSK3是一个多功能的丝氨酸／苏氨酸类激酶，在真核生物中普遍存在。在动物中参与诸如糖原合成、多种蛋白的转录激活和发育调控、细胞增殖、分化和凋亡等许多生命活动的信号转导,具有广泛的细胞调节功能［9］。越来越多的证据［6］表明GSK3β是凋亡的主要调节因子；营养因子减少导致神经元凋亡也提示是由GSK3β活化介导。Akt是GSK3β的上游激酶，其激活可以引起GSK3β的抑制。Akt可以在Ser 9位点上使GSK3β磷酸化，因此使GSK3β失活。在我们的前期实验［1］中发现，给予红景天甙干预后，PD模型小鼠纹状体蛋白的胶质源性神经营养因子（GDNF）分泌增加，黑质多巴胺能神经元在一定程度上得到了保护。本实验PD组小鼠Akt在Ser 473位点上的磷酸化水平明显低于正常对照组和红景天甙组（均P<0.01），表明红景天甙能增加Akt蛋白的磷酸化激活，这对神经元的存活非常有利。同时，也发现在Akt通路的下游信号蛋白中，红景天甙组pGSK3β(ser 9)表达显著增加，使GSK3β磷酸化，抑制了GSK3β的活化，这可能起抗凋亡的作用，使神经元损伤程度减轻。　　GSK3β的激活也介导了由于营养因子减少引起的神经元凋亡［10］。 GSK3β也可能是几种凋亡途径的关键介导因子，可以引起Caspase3的激活，促进一系列的凋亡过程［11］。本研究结果显示红景天甙的干预减弱了Caspase3 的活化程度。此外，Bcl2是一个抗凋亡蛋白，在调节多种形式的凋亡过程中起重要作用，BAD抑制Bcl2的作用，Bcl2/BAD比值是一种细胞存活的标记［12-14］。本实验发现，红景天甙在一定程度上提高了Bcl2 表达和降低了BAD表达的水平 ，使Bcl2/BAD的降低程度减小。提示红景天甙不仅启动细胞的生存信号，而且激活抗凋亡信号蛋白，抑制凋亡信号蛋白表达。 因此，PI3K/PBK是红景天甙神经保护作用的一条重要信号途径，而Akt、GSK3β、Caspase3、BAD和Bcl2可能是该途径上起主要作用的靶点。【参考文献】　　［1］张宇红，陈生弟，李江林,等.红景天甙促进帕金森病模型小鼠表达内源性GDNF保护多巴胺能神经元［J］.中华神经科杂志，2006, 39:540.　　［2］Cheng CM, Reinhardt RR, Lee WH, et al. 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