谷氨酰胺对大鼠肝门阻断后肝脏Bcl-2 mRNA表达的影响及其保护作用

谷氨酰胺对大鼠肝门阻断后肝脏Bcl-2 mRNA表达的影响及其保护作用作者：刘国平　朱闻溪　杨广顺　周文平　程广明    作者单位：1沈阳军区总医院　肝胆外科　 2中国医科大学 3上海东方肝胆外科医院    【摘要】  目的：探讨谷氨酰胺（L-glutamine，Gln）对肝门阻断后肝脏细胞凋亡及Bcl-2 mRNA表达的影响。方法：雄性Wistar大鼠，随机分为假手术组（A组）、对照组（B组）和实验组（C组）3组。采用Pringle’s法进行肝门阻断，持续35 min，肝门阻断前C组大鼠腹腔注射Gln。分别于肝门阻断前及再灌注后2、4和24 h，每组各选取10只大鼠，测定血清ALT、AST、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）含量；检测肝组织谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量；采用原位末端脱氧核苷酸转移酶法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated DUTP nick end labeling method，TUNEL）检测肝脏细胞凋亡，并计算凋亡指数（apoptosic index，AI）；采用RT-PCR方法检测肝Bcl-2 mRNA的表达。结果：与B组相比，再灌注后C组肝组织中MDA含量下降（P<0.05），而GSH水平增高（P<0.05）； 血清ALT、AST、LDH含量及AI均明显降低（P<0.05）；Bcl-2 mRNA表达则显著增强（P<0.05）。结论：Gln能够减轻过氧化损伤，上调肝脏Bcl-2 mRNA的表达，抑制肝细胞凋亡，从而在肝门阻断中发挥保护作用。    【关键词】  肝门阻断·谷氨酰胺·肝细胞·细胞凋亡·基因，Bcl-2    Effect of L-glutamine on liver Bcl-2 mRNA expression after total hepatic inflow occlusion in rats  LIU Guo-ping1, ZHU Wen-xi2, YANG Guang-shun3, ZHOU Wen-ping1,  CHENG Guang-ming1 1Department of Hepatobiliary Surgery， General Hospital of Shenyang Military Region （Shenyang 110015, China）2China Medical University（ Shenyang 110011, China）3Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital（Shanghai  200438, China ）    【ABSTRACT】 Objective:To explore the effect of L-glutamine（Gln） on liver Bcl-2mRNA expression and apoptosis after total hepatic inflow occlusion in rats. Methods: Male Wistar rats were assigned randomly to three groups （n=40）: Group A sham-operation group, group B control group, rats were pretreated with 4 ml 0.9% saline intraperitonally twice per day on 5 consecutive days, group C, rats were pretreated with Gln dissolved in 4 ml 0.9% saline intraperitoneally twice per day on 5 consecutive days. The rats from group B and C underwent total hepatic inflow occlusion for 35min by the pringle's manoeuvre. Ten rats from each group were randomly chosen and killed before the initiation of occlusion at 2 h, 4 h, 24 h after reperfusion respectively. The levels of MDA, GSH in liver tissue were measured. The serum concentrations of ALT, AST, LDH were assayed on a standard biochemistry autoanalyser. The expression levels of Bcl-2 mRNA in liver were assessed by RT-PCR. The apoptosis of liver were observed by DUTP method. The percentage of apoptosis was analyzed. Results: Compared with group B, the levels of GSH in group C increased after reperfusion （P<0.05）. But the levels of ALT, AST, LDH, MDA and AI decreased （P<0.05）. Among the three groups, Bcl-2mRNA expression in group C was the strongest. Conclusion: Gln might alleviate lipid peroxidation-mediated injury of liver, enhance the expression of Bcl-2mRNA and prevent the hepatic cells from apoptosis after the pringle's manoeuvre.    【KEY WORDS】 Pringle’s manoeuvre·L-glutamine·Apoptosis·Hepatocytes·Genes，Bcl-2    谷氨酰胺（L-glutamine， Gln）作为一种具有特殊药理学作用的营养物质，具有维护肠黏膜屏障、防止内毒素及细菌易位的作用，是近20年来外科研究的热点，虽然在临床中已获得广泛应用，但其对于肝脏缺血再灌注损伤的影响却鲜有报道。本研究采用肝门阻断的动物模型，探讨Gln对肝脏脂质过氧化损伤、细胞凋亡及Bcl-2 mRNA表达的影响。1　材料与方法    1.1　实验动物分组及处理　雄性Wistar大鼠120只，体质量300～350 g ,随机分为3组（n=40）。假手术组（Ａ组）；对照组（Ｂ组）：生理盐水腹腔注射，４ mL/次，2次/d，连续5 d；实验组（Ｃ组）： Gln溶液（300 mg/kg，用生理盐水稀释至4 mL）腹腔注射，2次/d，连续5 d。大鼠术前禁食12 h，自由饮水。所有大鼠均采用戊巴比妥钠（按体质量3.5 mg/100 g）腹腔内注射进行麻醉。每组随机选取10只大鼠，自心脏取血5 mL,静置20 min，4 000 r/min离心10 min，分离血清，-30 ℃保存待测。切取肝组织，其中一部分-70 ℃保存待测，另一部分放入10％甲醛中固定。余下的大鼠除A组仅行麻醉和开腹术外，均沿腹正中切口切开腹腔，显露第一肝门，采用Pringle’s法用无创血管夹阻断肝十二指肠韧带，持续35 min后，撤夹恢复血流。分别于再灌注后2、4和24 h每组各选取10只大鼠处死，分离血清，置于-30 ℃冰箱中保存，并采集肝标本保存待测。    1.2　主要试剂　Gln由上海康达氨基酸厂提供；凋亡试剂盒购自武汉博士德公司；大鼠Bcl-2引物参照Genebank，由TaKaRa（大连）公司合成，Bcl-2扩增产物长度为287 bp，上游：5’-CACCCCTGGCATCTTCTCCTTC －3’, 下游：5’－CACAATCCTCCCCCAGTTCACC－3’；内参照磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物由TaKaRa（大连）公司合成；GAPDH扩增产物长度为528 bp，上游：5’－ ACCACCATGGAGAAGGCCGG－ 3’, 下游：5’－ CTCAGTGTAGCCCAGGATGC－ 3’；Trizol总RNA提取试剂购自美国Promega公司；反转录试剂盒及PCR扩增所需的其他试剂购自TaKaRa（大连）公司；电泳用聚丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）及琼脂糖等购自上海化工生物工程公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA） 、谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒及总蛋白定量试剂（双缩脲）由南京建成生物研究所提供，试剂配置及试剂序号按照试剂盒说明书所述。    1.3　检测方法　血清ALT、AST、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）含量采用岛津CL-7150全自动生化分析仪测定。肝脏MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。肝脏GSH水平采用比色法测定。每组在各个时相点分别随机选取5只大鼠的肝标本，采用原位末端脱氧核苷酸转移酶法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated DUTP nick end labeling method，TUNEL）检测细胞凋亡，每张切片随机取5个视野（×400），计数阳性细胞数及每个视野细胞总数。计算凋亡指数（apoptosic index，AI），AI（％）=（阳性细胞数/观察细胞总数）×100%。采用RT-PCR的方法检测肝组织中Bcl-2 mRNA的表达。    1.4　统计学处理　采用SPSS 10.0统计软件进行完全随机设计方差分析，数据结果均以x±s表示，样本之间采用LSD法进行两两比较。P≤0.05为差异有统计学意义。2　结果    2.1　肝组织GSH水平的变化　C组肝脏组织GSH水平明显高于B组（P<0.05）。与A组相比，再灌注后B组GSH水平明显降低（P<0.05）；C组在再灌注后24 h明显降低，而术前则明显高于A组（P<0.05，表1）。    2.2　肝组织MDA水平的变化　再灌注后C组肝脏MDA水平明显低于B组（P<0.05）。与A组相比B组MDA水平明显增高（P<0.05）。再灌注后2、4 h，C组MDA水平明显高于A组（P<0.05，见表1）。    2.3　血清ALT、LDH、AST水平的变化　再灌注后C组ALT、LDH、AST水平明显低于B组（P<0.05）； B组则明显高于A组（P<0.05，见表1）。    2.4　大鼠肝脏细胞AI的变化　再灌注后各时相点，C组肝脏细胞AI明显低于B组（P<0.05）； B、C组则明显高于A组（P<0.05）；术前各组间无统计学差异（见表1及图1）。    2.5　各组大鼠肝脏Bcl-2 mRNA表达的变化　术前A、B组肝脏未见Bcl-2 mRNA表达，C组有微弱表达，有统计学意义（P<0.05）。再灌注后2、4、24 h，A组肝脏均未见Bcl-2 mRNA表达；B组表达稍增强，与之相比，C组表达显著增强（P<0.05，表2及图2 ）。3　讨论    1999年Kohli等［1］在大鼠70%肝脏缺血再灌注模型中发现大量肝细胞和内皮细胞凋亡；Camargo等［2］证明正常大鼠肝脏热缺血时间超过90 min，才可见到明显肝细胞坏死，表明细胞凋亡是肝脏缺血再灌注损伤的重要病理改变。本研究也证实肝门阻断后，肝脏出现了明显的细胞凋亡改变。细胞凋亡与机体的氧化应激状态密切相关。本研究结果显示肝门阻断再灌注后肝组织MDA水平明显增高，并且与凋亡指数的增高是同步的，这表明两者之间存在着一定程度的关联性。    减少肝细胞凋亡，对于减轻肝门阻断后肝脏的缺血再灌注损伤，改善机体状态具有非常重要的意义。为此，本研究在肝门阻断前预先给予Gln，发现肝脏细胞的AI较对照组明显降低，这表明Gln具有抑制肝细胞凋亡的作用。其机制可能为：1）Gln有助于提高与维持肝组织中GSH的含量，后者具有抗氧化抗凋亡的作用。本研究发现肝门阻断前给予Gln即可提高肝组织GSH水平；再灌注后2h和4 h GSH水平虽然也有所下降，但与假手术组相比，无明显差异，均明显高于对照组。2）Gln可抑制肝门阻断再灌注后肠源性内毒素易位，降低TNF-α水平，并减轻肠道的脂质过氧化损伤, 从而抑制肠道活性氧群的产生及释放入门静脉血［3］。无论是内毒素、TNF-α，还是活性氧群，都会直接或间接地诱导肝细胞凋亡，因此Gln在一定程度上削弱了上述促凋亡因素的作用。    肝细胞凋亡后，细胞质内的酶释放到血循环中，表现为转氨酶升高。本研究发现在肝门阻断前预防性给予Gln，可降低再灌注后转氨酶水平，可能与Gln抑制肝脏细胞凋亡的作用有关。    细胞凋亡是一种受基因调控的自身程序性细胞死亡。目前研究得最多、最主要的调控基因是Bcl-2家族。张浩等［4］发现移植再灌注肝组织中，细胞凋亡可能与凋亡抑制基因Bc1-2的低表达及凋亡诱导基因Bax和Fas的高表达有关。提高Bc1-2基因的表达，可能有助于减少缺血再灌注肝脏的细胞凋亡。本研究发现Gln能显著上调Bc1-2 mRNA在肝细胞中的表达，说明Bcl-2可能与Gln抑制肝门阻断后肝脏细胞凋亡的保护机制有关。    关于Gln促进Bcl-2 mRNA表达的机制尚不清楚，本研究中发现，Gln具有增加肝脏GSH含量，减轻脂质过氧化损伤的作用。另有研究显示Gln能增加细胞膜的稳定性［5］。由于Bcl-2多位于细胞的膜性结构，如核膜、粗面内质网和线粒体膜上，而膜性结构最易遭受脂质过氧化损伤，因此可做出假设：Gln具有相对稳定Bcl-2蛋白结构的作用。本研究结果显示肝门阻断再灌注后Bcl-2基因表达增加，这可能是一种机体代偿性反应，如果细胞的膜性结构被大量破坏，Bcl-2蛋白结构不能维持，这种代偿性反应就会不充分；而给予Gln将减轻细胞膜性结构的破坏，有助于稳定膜上Bcl-2蛋白的结构，促进这种代偿反应的发生。该假设还有待进一步证实。【参考文献】[1] Kohli V, Selzner M, Madden JF, et al. Endothelial cell and hepatocyte deaths occur by apoptosis after ischemia-reperfusion injury in the rat liver[J]. Transplantation, 1999,67（8）:1099-1105.[2] Camargo CA, Madden JF, Gao W, et al. Interleukin-6 protects liver against warm ischemia/reperfusion injury and promotes hepatocyte proliferation in the rodent[J]. Hepatology, 1997,26（6）:1513-1520.[3] 刘国平，朱闻溪，杨广顺，等.谷氨酰胺对肝门阻断后肠道损伤的影响及其意义[J].中国现代普通外科进展，2007，10（2）：131－134.[4] 张浩，钱建民，王学浩.大鼠肝脏移植再灌注细胞凋亡与凋亡调控的研究.[J].中华实验外科杂志，2002，19（4）：352－353.[5] Portella AO, Montero EF, Poli de Figueiredo LF, et al. Effects of N-acetylcysteine in hepatic ischemia-reperfusion injury during hemorrhagic shock[J].Transplant Proc, 2004,36（4）:846-848.