大鼠甲状旁腺细胞体外培养及功能的实验研究
发表时间：2010-02-10 浏览次数：729次
大鼠甲状旁腺细胞体外培养及功能的实验研究作者：段秀庆 李永宁 宋纯 作者单位：1哈尔滨医科大学第一临床医学院 普外科 2大连辽渔医院 外科 3哈尔滨医科大学第一临床医学院 卫生部细胞移植重点实验室 【摘要】 目的： 探讨大鼠甲状旁腺细胞的培养方法及其分泌功能，为甲状旁腺细胞移植奠定实验基础。方法： 胶原酶和胰蛋白酶系列消化甲状旁腺后，进行细胞培养。透射电镜检查培养5 d的甲状旁腺细胞，对1、3、5、7 d的细胞培养液行甲状旁腺激素测定。结果： 培养5 d的甲状旁腺细胞具有丰富的粗面内质网、高尔基复合体、杆状的线粒体和分泌颗粒。甲状旁腺细胞经过培养后可以正常分泌甲状旁腺激素，以第5天为最佳。结论：培养5 d的甲状旁腺细胞仍保持原有的形态结构，分泌功能最强，可作为同种移植的最佳供体。 【关键词】 甲状旁腺·细胞培养·甲状旁腺激素 Experimental study on the cell culture and secretory function of parathyroid cells in rats DUAN Xiu-qing1, LI Yong-ning2, SONG Chun3 1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University ( Harbin 150001, China) 2Department of Surgery, Dalian Liaoyu Hospital (Dalian 116000, China) 3Cell Transplantation Key Laboratory of National Health Ministry, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University ( Harbin 150001, China) 【ABSTRACT】 Objective: To investigate the culture technique and secretory function of parathyroid cells in rats in order to establish experimental basis of parathyroid cell transplantation. Methods: After parathyroid glands were digested by collagenase and trypsin, isolated parathyroid cells were cultured. The cells cultured for 5 days were observed by transmission electron microscopy. donor HLA class I antigens[J]. Science, 1991,252(5013):1700-1702. tively. Results: Parathyroid cells cultured for 5 days had abundant rough surfaced endoplasmic reticula、Golgi bodies、stab mitochondria and secretory granules. Cultured parathyroid cells could secrete parathyroid hormone normally, especially on the 5th day. Conclusion: Parathyroid cells cultured for 5 days still possess original morphologic structure and have maximum secreting function, so it is an optimal donor for transplantation. 【KEY WORDS】 Parathyroid gland·Cell culture ·Parathyroid hormoneParathyroid hormone obtained from the cell culture fluid on day 1，3，5 and 7 was measured respec 甲状旁腺功能低下症（简称甲旁低）是甲状腺术后的严重并发症，极大地影响患者术后的生活质量。目前多采用维生素D和钙剂治疗，尚无有效的激素替代疗法［1］。为了达到钙、磷的生理调节，避免钙剂治疗所产生的副作用，甲状旁腺（parathyroid gland， PTG）移植已渐成为治疗甲旁低的主要手段［2］。本研究对PTG细胞的体外培养方法进行探讨，为PTG细胞移植奠定实验基础。1 材料与方法 1.1 实验材料 2～3周龄Wistar大鼠18只，雄性，体质量25~50g，由哈尔滨医科大学第一临床医学院实验动物中心提供。主要试剂和仪器包括胶原酶V（Sigma公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、RPMI 1640培养液(Gibco公司)、甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)N-tact PTH IRMA 26100放免试剂盒 (美国DiaSorin公司)、JEM-1220透射电镜（日本JEOL公司）和CO2培养箱（德国Heraeus公司）。 1.2 实验方法 1.2.1 PTG切取与细胞培养 Wistar大鼠腹腔注射麻醉，无菌手术切取双侧PTG，经病理组织学检查证实。将组织置入4℃ RPMI 1640培养液中漂洗，吸除培养液，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块。加入2.5%的胶原酶在37℃恒温水浴中振荡消化10 min，然后用Hank’s液洗2遍，再以0.25%的胰蛋白酶消化5 min，RPMI 1640（含15%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 g/mL）培养液终止消化。离心去上清后移入含RPMI 1640培养液的培养瓶中。细胞浓度为1×105 mL-1。台盼蓝染色计数细胞活力，培养瓶置于37℃内充95%空气，5% CO2的培养箱中恒温培养。倒置显微镜下观察不同时段的细胞形态。 1.2.2 PTH测定 无菌技术收集1、3、5、7 d的PTG细胞培养液各9瓶，-80℃冻存备用，统一检测PTH。 1.2.3 透射电镜观察 采用无菌技术在培养5 d的PTG细胞培养瓶内加入1.0 mL 0.25%的胰蛋白酶液（预加温至37℃），静置3 min，其间置于倒置相差显微镜下观察。待细胞质回缩、细胞间隙增大后，立即加入含有胎牛血清的培养液终止消化。用吸管吸取培养液，轻轻反复吹打瓶壁细胞，然后将细胞悬液移入离心管，离心去上清后立即沿管壁加入3%戊二醛固定，常规切片，透射电镜观察。
1.3 统计学处理 采用SPSS11.5软件包进行数据分析，数据均以x±s表示，两样本间用t检验，检验水准α=0.05。 2 结果 2.1 PTG细胞形态的观察 各培养瓶中PTG细胞成活率均＞90%。倒置显微镜下见细胞散在分布，呈圆形，均质且透明。12 h后细胞附于培养瓶底面，并见少数细胞开始放射状延展。72 h后细胞大部分贴壁并相互连接成片，呈多角形或星形，细胞核圆、居中，呈现上皮细胞的形态特征。此后细胞完全贴壁，可见少量成纤维细胞（图1）。 2.2 PTH测定结果 第1、3、5和7天PTG细胞培养液的PTH水平分别为（17.79±2.77）、（45.07±7.42）、（76.49±6.86）和（53.61±5.53）ng/L。以培养5 d的PTG细胞分泌PTH最高，与培养1、3和7 d的PTH分泌水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。 2.3 透射电镜检查结果 培养的PTG细胞形态完整，细胞器和细胞核保持良好。游离面可见微绒毛，胞质内见丰富的粗面内质网、杆状的线粒体和电子密度较高的分泌颗粒，靠近细胞核可见发达的高尔基复合体（图2）。3 讨论 PTG是通过分泌PTH来调节体内钙代谢，从而实现钙、磷的平衡。甲旁低由于活性PTH减少或测不到，而出现低钙血症和高磷血症，严重地影响了患者的生活质量。PTG移植因其独特的优势有望成为治疗甲旁低的有效手段。1）体外培养的PTG细胞可以有更好的血管重建，降低了主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）抗原的表达［3］；2）可以控制移植的细胞数量；3）可在细胞生长状态最佳时进行移植或低温保存建立细胞库；4）可以对培养的PTG细胞进行预处理，降低受体的免疫排斥反应［4］；5）对缺血和缺氧的耐受性提高。 足够数量的PTG细胞是保证细胞移植成功的前提条件。而消化是关系到培养成败与否的重要步骤。为了最大限度地减少蛋白酶的影响，本研究采用胶原酶和胰蛋白酶系列消化法，将两种酶的作用机制有机地结合，克服了因单纯胰蛋白酶消化较难控制出现的消化时间短或消化过度的不足，获得了数量更多且有功能的PTG活细胞。 切取的PTG组织细胞经过细胞培养能够正常分泌PTH是细胞移植后治疗甲旁低的关键。本研究发现PTG细胞在培养12 h后开始贴壁，呈现出上皮细胞的形态特征；透射电镜观察培养的PTG细胞以主细胞为主，形态完整，有发达的高尔基复合体，富于粗面内质网和分泌颗粒，有杆状的线粒体，说明培养后的PTG细胞仍保持原有的结构，具备分泌PTH的条件。同时，对其培养液进行PTH测定，结果显示培养的PTG细胞仍然可以正常分泌PTH，第1天即可测到PTH，第5天达到高峰，之后逐渐下降。由此推测培养5 d的PTG细胞分泌功能最强，状态最佳，可作为移植的最佳供体。 在成功消化、培养大鼠PTG细胞，并对其进行功能测定的基础上，本研究认为可以对PTG细胞实施各种预处理，如冷冻保存或将其用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊包被等，以进一步降低其免疫原性，达到局部免疫耐受的目的，为甲旁低的治疗提供更加确实有效的手段。但需进一步的基础和临床研究给予支持。【参考文献】[1] Marx SJ. Hyperparathyroid and hypoparathyroid disorders[J]. N Engl J Med, 2000,343(25):1863-1875.[2] Drueke TB, Cattan P, Zingraff J, et al. Endocrine-cell allotransplantation[J]. Lancet, 1998,351(9120): 597-598.[3] Tsuji K, Fuchinoue S, Kai K, et al. Culture of human parathyroid cells for transplantation[J]. Transplant Proc, 1999,31(7):2697.
