用于再灌注损伤研究的两种肝移植模型的筛选

用于再灌注损伤研究的两种肝移植模型的筛选作者：冯敏　陶立德　张培建　刘新颜　金成　郎洁    作者单位：扬州大学第二临床医学院　普通外科　(江苏　扬州　225001)    【摘要】  目的：筛选一种用于研究肝移植过程中缺血再灌注损伤的大鼠肝移植模型。方法：将SD大鼠随机分为假手术组(S组)、原位肝移植组(OLT组)与自体肝移植组(AT组)。比较各组大鼠手术时间、存活率及术后24 h血清中总胆红素(TB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，观察肝组织形态学改变。结果：与S组相比OLT组、AT组术后血清TB、ALT、AST升高明显，AT组较OLT组术后存活率明显提高，血清TB、ALT、AST及TNF-α含量明显降低，肝形态异常变化减轻(P<0.05)。结论：自体肝移植模型手术简单、成功率高、可比性强，且排除了免疫损伤的影响，更好地反映了肝脏缺血再灌注损伤的病理生理过程，比较适宜作为肝移植缺血再灌注损伤研究的动物模型。    【关键词】  肝移植·再灌注损伤·大鼠    Comparison study on two liver transplantation models for reperfusion injury　FENG Min, TAO Li-de, ZHANG Pei-jian, LIU Xin-yan, JIN Cheng, LANG Jie　Department of General Surgery, the Second Clinical Medical College, Yangzhou University (Yangzhou 225001, China)　　【ABSTRACT】 Objective: To select a more suitable liver transplantation model for studying ischemic reperfusion injury. Methods: SD rats were randomly divided into three groups: sham operation group (S), orthotopic liver transplantation group (OLT) and analogic liver transplantation group (AT). The requirement for micro-surgical skills, survival rate and deterioration of histomorphology after operation among each group were observed. At the same time , the levels of total bilirubin (TB), alanine aminotransferase(ALT), glutamic oxalacetic transaminase(AST) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) in the serum at 24 hours after operation were recorded. Results: The levels of TB, ALT,AST and TNF-αin AT group and OLT group were higher than those in S group. In AT group the pathological changes were milder and the levels of TB, ALT,AST,TNF-αwere lower in AT group (P<0.05)comparing with OLT, and AT group required micro-surgical skills and had higher survival rate(P<0.05). Conclusions: AT simplifies the procedure of OLT. It really reflects the pathophysiologic course of ischemic reperfusion injury, therefore it can be chosen as an ideal model for studying ischemic reperfusion injury in liver transplantation.　　【KEY WORDS】 Liver transplantation·Reperfusion injury·Reperfusion　　缺血再灌注损伤存在于任何术式肝移植手术过程中，是造成移植肝无功能的重要原因之一。为了研究肝移植过程中缺血再灌注损伤，大多采用Kamada等[1-2]提出的“双袖套法” 创建大鼠肝移植模型。此模型手术操作难度大，存活率低且不能排除免疫排斥因素对术后供肝的影响。因此，选择一种研究缺血再灌注损伤适宜的肝移植模型很有必要。1　材料与方法　　1.1　试验动物　清洁级SD大鼠，雌雄不限，鼠龄8~10周，质量250～300 g(平均280 g)。江苏省实验动物中心提供，许可证号：SYXK(苏)2002-0045。　　1.2　主要材料与仪器　酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(北京晶美生物工程有限公司)，阿托品注射液、乙醚(上海第一生化药业有限公司)，注射用低分子量肝素钠(江苏万邦生化医药股份有限公司)。JEM-2000EX型透射电镜(日本，Olympus)，PM10SP型光学显微镜(日本，Olympus)，MiVnt显微图象分析系统(上海，光学仪器厂)，SP-2102UV型紫外可见分光光度计(上海，光谱仪器有限公司)，FA1004N型电子天平(上海，精密仪器仪表有限公司)，动物实验手术台及显微外科手术器械购于上海医疗器械有限公司手术器械厂。　　1.3　实验方法　　1.3.1　分组　SD大鼠随机分为3组，各组有效例数50例。1)假手术组(S组)：进腹后游离肝周围韧带，解剖分离第一肝门，游离下腔静脉(IVC)，不夹闭任何血管亦不灌注;2) 原位肝移植组(OLT组)：采用“双袖套法”建立大鼠异体肝移植模型;3)自体肝移植组(AT组)：根据熊力等[3]的方法制作自体肝移植模型。　　1.3.2　检测指标　3组大鼠各8只用于术后24 h取材，其余留作存活率观察。检测指标：1) 血清中总胆红素(TB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)，下腔静脉取血2 mL，扬州大学第二临床医学院检验科血生化室AV800全自动生化分析仪检测。2) 血清肿瘤坏死因子(TNF-α)含量用 ELISA法测定。3)肝组织形态学检测：电子显微镜观测由扬州大学检测中心协助完成;光学显微镜检查为常规切片，HE染色。检测用肝组织统一取右前叶。　　光学显微镜观察：每只随机摄取6个×400倍视野;电子显微镜观察：每只随机摄取6个×23 000倍视野。用MiVnt图象分析系统定量分析肝细胞核平均面积、线粒体光密度。各标本数值取6张图像的均数。　　1.4　统计学处理　采用SPSS12.0统计软件包进行分析，实验数据以x±s表示。组间比较采用独立t检验。检验水准为α=0.05。2　结果　　2.1　手术时间、成功率及术后存活率　OLT手术87只，成功50只(成功标准为术后大鼠能立即翻身、觅食)，手术成功率57.5%，术后24 h存活37只，术后15 d存活21只，存活率分别为74.0%，50.0%。AT手术54只，成功50只，手术成功率92.6%，术后24 h存活46只，术后15 d存活36只，存活率分别为92.0%，85.7%，与OLT组相比差异有统计学意义(P<0.05)。手术时间见表1。　　2.2　血清TB、ALT及AST含量的变化　OLT组及AT组术后24 h TB、ALT、AST较S组明显增高(P<0.05)，AT组较OLT组低(P<0.05，见表2)。　　2.3　血清TNF-α含量　术后24 h AT组与OLT组，血清中TNF-α含量均较S组(9.1±0.8) pg/mL高(P﹤0.05)，AT组为(23.3±1.2) pg/mL，明显低于OLT组(63.2±7.4) pg/mL(P<0.05)。　　2.4　形态学改变　OLT组术后24 h病理切片，肝细胞水肿明显，大量炎细胞浸润，局部区域出现大片状坏死(图1);AT组肝组织水肿程度较OLT组轻，组织间可见炎细胞浸润，偶见点状变性、坏死(图2)。电镜下AT组与OLT组细胞核及线粒体肿胀程度较S组重(P﹤0.05)，OLT组细胞核面积较AT组大，线粒体光密度较AT组小(P﹤0.05，表3)。细胞核面积越大、线粒体光密度越小提示细胞水肿越明显[4]。3　讨论　　本研究OLT与AT两种肝移植模型，AT手术难度小，显微外科技术要求较OLT低，一般经50例左右训练均可达到90%以上的手术成功率。此外，AT可精确控制无肝期和肝脏冷缺血时间，模型建立比较稳定，节约试验材料，解决了OLT肝动脉吻合困难的问题。本研究中OLT组术后肝功能、血清TNF-α水平及细胞形态学检测均提示其炎症损伤较AT组重。对于OLT组，很难指出这些损伤主要是免疫排斥、缺血再灌注还是手术操作引起。影响OLT组术后各项检测指标的因素多，而且关系复杂。相比之下，AT简化了多种损伤因素，更适合用于肝移植过程中缺血再灌注损伤的研究。　　但造模过程中仍需注意以下几个方面：1)麻醉：乙醚易刺激呼吸道，引起呼吸道分泌物过多而窒息或术后并发肺部感染。术前10 min阿托品肌肉注射，可减轻乙醚刺激引起的呼吸道分泌。大鼠无肝期，血液循环受到严重影响，麻醉药物代谢减慢，此时应相应减轻麻醉深度，但仍要保持有效麻醉，以免大鼠清醒欲起身挣扎，严重影响以后的手术操作。术中麻醉的深浅可根据大鼠的呼吸状态和肝脏的颜色来判断麻醉深浅，调节用量[5-6]。2)出血：出血是大鼠术中和术后24 h内死亡的主要原因，其中几处隐蔽血管的处理不当易致出血。食管与肝的韧带间有一较粗血管，如不注意处理，往往导致出血。结扎右肾上腺静脉操作较困难，需要剪开肝下下腔静脉与右肾上腺之间的疏松组织，才能较清楚地暴露右肾腺上静脉。肝上下腔静脉后方的膈肌回流静脉血管多且变异较大，多无法结扎，夹闭肝上下腔静脉时，应靠近肝上缘嵌夹，避免遗漏膈肌汇入腔静脉的血管而造成失血。肝动脉较脆，加之大鼠全身肝素化后凝血功能较差，血管夹钳夹肝动脉易造成术后出血，因此对不做胆管研究的肝移植模型[7]，直接结扎肝动脉较为稳妥。3)肝脏灌洗：AT术中肝脏灌洗不同于OLT，本研究在OLT术中对供体肝脏经腹主动脉行冷灌注，一方面减轻对门静脉的机械性灌注损伤;同时灌注液既可直接经肝动脉灌洗肝脏，又可经腹部各器官循环后进入门静脉灌注肝脏，使肝脏得到双重灌注，灌洗更均匀、更彻底后。AT大鼠，为保证大鼠存活，无法实施由腹主动脉灌注，只能经门静脉灌肝。为保证获得良好的灌注效果，首先，注意游离肝脏的手术操作要轻柔，避免损伤肝脏局部造成微血栓，影响灌肝;其次，在阻断肝脏血流后要迅速插入灌注针进行灌肝，因为大鼠血液高凝，易形成血栓;再次，肝脏灌注时，压力恒定，低压灌注，避免冲坏血窦[8]，可用棉签轻柔的挤压肝脏，促使动脉系统的血液流出，同时注意防止肝叶折叠，影响肝脏灌注。4)体温控制：机体每降低体温1 ℃，代谢率就降低6 %。尽管低温时机体可通过降低代谢率减少对氧的需求，但低温引起的氧传送能力的下降仍可导致较严重的缺氧。在大鼠肝移植术中，除手术造成的代谢障碍，冷灌注液灌肝以及麻醉均可造成术后低体温，影响脏器功能恢复，增加大鼠术后死亡。因此，术中除对供肝局部降温外，应注意全身保温。【参考文献】　　[1] Kamada N, Calne RY. A surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rats[J]. Surgery, 1983,93(1):64-69.　　[2] Sharp FR, Ran R, Lu A, et al. Hypoxic preconditioning protects against ischemic brain injury[J]. NeuroRx, 2004,1(1):26-35.　　[3] 熊力，王玉柱，叶启发.大鼠自体原位肝移植灌注模型的技术改良[J].中国普通外科杂志，2008，17(7):716-717.　　[4] Kim JS, He L, Lemasters JJ. Mitochondrial permeability transition: a common pathway to necrosis and apoptosis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003,304(3):463-470.　　[5] Kashfi A, Mehrabi A, Pahlavan PS, et al. A review of various techniques of orthotopic liver transplantation in the rat[J]. Transplant Proc, 2005,37(1):185-188.　　[6] 彭勇，龚建平，刘长安. 大鼠原位肝移植模型制作过程中麻醉方法的选择[J].中国普通外科杂志，2003，12(9)，673-676。　　[7] Li J, Dahmen U, Dirsch O, et al. Modified sleeve anastomosis for reconstruction of the hepatic artery in rat liver transplantation[J]. Microsurgery, 2002,22(2):62-68.　　[8] Tokunaga Y, Ozaki N, Wakashiro S, et al. Effects of perfusion pressure during flushing on the viability of the procured Liver using noninvasive fluorometry[J]. Transplantation, 1988,45(6):1031-1035.