进展期胃癌术中动脉化疗对p53和ki-67表达及细胞凋亡作用的影响

进展期胃癌术中动脉化疗对p53和ki-67表达及细胞凋亡作用的影响作者：何运胜　姜淮芜　汪盛贤　肖仕明　刘小波    作者单位：1川北医学院附属第二医院　普外二科　（四川　绵阳　621000） 2成都军区总医院　病理科　（四川　成都　610000） 3梓潼县中医院　普外科　（四川　绵阳　622150）    【摘要】  目的：观察进展期胃癌术中动脉化疗对原发灶和癌旁转移淋巴结p53、ki-67表达和细胞凋亡的影响。方法：35例进展期胃癌随机分为2组，20例术中经胃周动脉灌注化疗药物即术中灌注（intraoperative artery infusion chemotherapy，IAIC）组，15例术前介入化疗即术前介入组。采用免疫组织化学SP法检测原发灶和癌旁转移淋巴结p53、ki-67蛋白基因表达和TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果：2组治疗前、治疗后p53、ki-67蛋白表达及细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）在动脉化疗前、后比较差异有统计学意义（P＜0.05）；2组立即有效性差异无统计学意义（P＞0.05）；IAIC组治疗后原发灶、癌旁转移淋巴结的p53、ki-67表达与术前介入组治疗后比较差异无统计学意义（P＞0.05）；IAIC组治疗后原发灶、癌旁淋巴结的AI不如术前介入组（P＜0.05）。结论：进展期胃癌IAIC可增强药代动力学优势和精确的靶向化疗，对减少和防止术中癌细胞的医源性扩散、种植及术后复发有重要的临床意义，IAIC可望成为进展期胃癌多模式治疗重要的组成部分。    【关键词】  进展期胃癌·药物疗法·p53·ki-67·基因表达·细胞凋亡    Effect of artery infusion chemotherapy on p53 and ki-67 and apoptosis in advanced gastric carcinoma    HE Yun-sheng1, JIANG Huai-wu1, WANG Sheng-xian2, XIAO Shi-ming1, LIU Xiao-bo3    1The Second Department of General Surgery，the Second Affilicated Hospital of Northern Sichuan Medical College （Mianyang 621000，China）    2Department of Pathology, Chengdu Military Region General hospital (Chengdu 610000, China),    3Department of General Surgury Zitong County Chinese Medicine Hospital (Mianyang 622150, China)    【ABSTRACT】 0bjective: To observe the effect of artery infusion in the treatment of advanced    gastric carcinoma. Methods：Thirty-five cases of advanced gastric carcinoma were randomly divided into intraoperative artery infusion chemotherapy （IAIC, 20 cases） and preoperative intervention chemotherapy （15 cases） groups. The specimen of preoperative gastroscopic biopsy samples and resected tissues were harvested. The gene expressions of p53 and ki-67 were analyzed, and situ terminal transferase-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） was used to detect the states of apoptosis. Results：There were significant differences in p53 and ki-67 expressions between two groups （P<0.05）. AI was lower in the metastasis lymph node of IAIC group （P<0.05）. Conclusion：IAIC was effective in decreasing and preventing iatrogenic cancer cell diffusion and recurrence in advanced gastric cancer.    【KEY WORDS】 Advanced gastric carcinoma·Drug therapy·p53·ki-67·Gene expression·Cell apoptosis    　　进展期胃癌（advanced gastric carcinoma, AGC）的最主要治疗手段是外科手术切除，但并不能改变AGC术后癌细胞残留、局部复发及远处转移的生物学特性［1］。研究认为通过术中超选动脉灌注抗癌药物，形成肿瘤局部区域高浓度来提高根治手术的效果、减少术中的医源性播散，可获得生存益处［2-5］。但这些结果主要为临床观察性研究，为此本研究观察术中动脉灌注化疗（intraoperative artery infusion chemotherapy，IAIC）后原发癌灶及癌旁转移淋巴结的p53、ki-67蛋白表达，癌细胞变形、凋亡变化，并以术前介入化疗作为对照，旨在评价IAIC的临床意义。1　资料与方法    1.1　一般资料　收集2007年9月1日—2008年3月1日入住川北医学院附属第二医院经胃镜、病理组织学确诊及术中确诊的进展期胃癌患者（包括贲门癌患者），且能够耐受开腹手术（贲门癌）能经腹完成的病例，纳入研究组，共35例，男23例，女12例。年龄40～79岁，中位年龄55.5岁。随机分为2组，20例行IAIC即术中灌注组（IAIC组），15例行术前介入化疗即术前介入组。按国际抗癌联盟（UICC）制定的TNM分期（1997年版），IAIC组Ⅱ期５例，Ⅲ期10例，Ⅳ期5例；术前介入组Ⅱ期3例，Ⅲ期8例，Ⅳ期4例。所有患者及家属自愿接受介入化疗和IAIC治疗方案，并签字为凭。早期胃癌及患者、家属不愿接受该方案的患者；不能够耐受开腹手术和贲门癌不能经腹完成的患者；入院前已接受了化疗及免疫制剂治疗（包括中药）等患者不纳入研究组。    1.2　主要试剂及仪器　注射用盐酸拓普替康：2 mg/瓶，由黄石飞云制药生产；顺铂注射液：20 mg/瓶，由云南个旧生物药业生产；替加氟注射液：5 mL，0.25 g/支，由齐鲁制药生产；Polymer Detection System For Immuno-Histological Staining PV-9000和TUNEL试剂盒：购于美国GBI公司；Olympus显微镜CX31-32L02（日本原装，购于湖北孝感市阳光神琦医药有限公司)；PAS-8000真彩色病理图像分析软件，购于成都帕萨罗杰仪器有限公司；动脉穿刺导管、导丝、鞘组，购于日本TURUMO公司；高压注射泵针筒、DSA连接管(南京嘉辰医疗器材有限公司)。    1.3　方法　    1.3.1　IAIC　IAIC组患者手术入腹后，胃近半癌经分离出胃左或胃网膜左动脉的灌注；胃远半癌经分离出胃网膜右动脉或胃右动脉灌注，置入导管并确认在动脉血管内，同时结扎伴行的静脉；生理盐水200 mL+拓普替康6 mg ,替加氟1.0 g，顺铂40 mg迅速动脉灌注。IAIC组血管选择：胃左动脉4例、胃右动脉3例、胃网膜右动脉9例、胃网膜左动脉4例。    1.3.2　术前介入化疗　术前介入组患者采用Seldinger法，用药成分及剂量同IAIC，超选动脉灌注，术前介入组血管选择：肝动脉3例、胃左动脉9例、胃右动脉3例，未作动脉栓塞，介入化疗后7～9 d（平均7.5 d）接受手术。    1.3.3　手术类型　2组Ⅱ、Ⅲ期患者行R0切除，D2+或D3淋巴结清除；Ⅳ期患者进行姑息切除，尽量行D2淋巴结清除。    1.3.4　病理组织学检查　35例患者术前门诊胃镜活组织检查标本、手术切除的大体胃癌标本及癌旁淋巴结标本经10％甲醛固定，常规脱水、透明、石蜡包埋，4 μm厚连续切片，分别作HE染色、免疫组织化学SP法染色及原位末端脱氧核苷酸转移酶标记（TUNEL法），光学显微镜下观察。以细胞核中出现棕红色颗粒为癌细胞蛋白阳性表达。    1.4　评价标准　立即有效性采用病理切片点计数与直接计数方法[6]，计算镜下变性、坏死癌细胞占全部癌细胞的构成比：0级（<25%）为(无效)；Ⅰ级(25%～)为轻度有效；Ⅱ级（50%～）为中度有效；Ⅲ级（≥75%）为明显有效；≥I级的记为有效，有效率（%）=有效例数/病例数×100%。    　　p53、ki-67蛋白表达及凋亡指数（apoptosis index，AI）计算方法［7］：选取10个高倍视野，用图像分析仪定量计数肿瘤细胞阳性表达数，每个标本计数细胞总数不少于200个， p53、ki-67蛋白阳性表达率（%）= 阳性表达细胞数／计数细胞总数×100%，AI=阳性表达细胞数／计数细胞总数。    1.5　统计学处理　应用SPSS11.5统计软件包进行分析，采用χ2检验，计数资料用x±s表示，有效率的等级资料采用非参数统计分析秩和检验（Wilcoxon），计量资料采用t检验。α=0.05为检验水准。2　结果    2.1　2组患者治疗后的有效率比较　IAIC组从灌注开始到手术切下标本最短的时间为80 min，最长的时间为135 min，平均85 min；术前介入组在介入化疗后7～9 d（平均7.5 d）接受手术。20例IAIC组术后立即有效性分别为0级2例、Ⅰ级2例、Ⅱ级9例、Ⅲ级7例，有效率为90%；而15例术前介入组为0级1例、Ⅰ级4例、Ⅱ级5例、Ⅲ级5例，其有效率为93%，2组间有效率对比差异无统计学意义（P＞0.05）。    2.2　进展期胃癌治疗前、后原发癌灶的p53、ki-67蛋白表达及AI的检测结果　p53、ki-67蛋白表达定位于原发灶癌细胞核，呈棕褐色（图1 A、C）；细胞凋亡小体定位于原发癌灶的细胞核，呈棕红色，凋亡细胞主要分布在腺上皮或腺管内，有成团的分布或散在分布，发生了明显的组织学改变，表现为癌细胞数量相对减少，核固缩且淡染变性，核质比例减小，纤维组织增生，部分伴有坏死灶，该变化在癌细胞浸润的前沿区域较为明显，并可见明显的细胞核固缩、碎裂(图2 A)。p53、ki-67及AI，2组治疗后明显优于治疗前（P＜0.05）；治疗后2组组间对比p53、ki-67蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；2组组间对比AI，术前介入组优于IAIC组（P<0.05，表1）。    2.3　进展期胃癌治疗后癌旁转移淋巴结的p53、ki-67及AI检测结果　p53、ki-67蛋白表达定位于癌症转移淋巴结细胞核上，呈棕褐色（见图1 E、F）；细胞凋亡小体定位于癌旁转移淋巴结细胞核上，呈棕红色，成团的分布或散在分布，发生了明显的组织学改变，核质比例减小，可见明显的细胞核固缩、碎裂(见图2 B)。治疗后IAIC组和术前介入组的p53、ki-67蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），AI比较，术前介入组优于IAIC（P＜0.05，见表1）。3　讨论    　　Araki等［8］早在1995年就提出并界定的术中局部灌注化疗(intraoperative local infusion chemotherapy，ILIC即IAIC），在理论上完全能够达到减少肿瘤的转移和复发的最终目的。肿瘤药代动力学研究表明，经胃左动脉给药时，胃壁组织中药物浓度较高，其癌缘药物的浓度可达全身化疗时的9～68倍，并可使门静脉中药物浓度达到全身化疗时的200倍，有效作用时间大大延长［9］，并可在癌组织、门静脉、肝脏和癌旁淋巴组织中均形成高浓度的“化疗浴场”，明显提高肿瘤局部及转移路径药物的浓度，且符合“为了提高胃癌患者的生存率，有必要加强胃癌肝转移的研究与治疗”的观点［10］，且抗肿瘤药物仅需在肿瘤组织中维持30 min就可导致癌细胞核发生固缩和碎裂［11］。    　　Soini等［12］在癌细胞中发现细胞增殖、凋亡和坏死的复合指标较任一单独指标能更准确地反映预后。癌基因的活化是促使肿瘤发生的关键因素之一，但抑癌基因的失活在肿瘤发生、发展过程中可能起到更加常见、重要的作用［12-13］。抗肿瘤药物通过破坏DNA介导肿瘤细胞凋亡，抑癌基因p53可诱导细胞发生调亡［14］，Meta定量分析认为p53表达是独立影响胃癌预后的重要参数［15］；而ki-67与细胞增殖密切相关，研究表明ki-67核抗原表达的胃癌具有较高的增殖活性，与胃癌的恶性生物学行为显著相关［16］。ki-67蛋白表达阳性率随着肿瘤浸润深度的增加而增加，生存期分析显示，ki-67高阳性表达胃腺癌患者预后差，5年生存率低(P＜0.01)。故在IAIC后，通过癌基因和抑癌基因的检测可快速反映癌细胞的生长状况。术前介入化疗后可明显上调p53、下调ki-67表达和促使AI上调［7,17］。本研究表明IAIC和术前介入化疗有等效作用，通过介导抑癌基因p53蛋白表达上调，从而发挥抑癌作用；高浓度大剂量药物随转移途径，杀死大量G1、S、G2、M期敏感的具有增殖活力的肿瘤细胞［18］，显著抑制肿瘤细胞增殖活性，降低癌细胞ki-67增殖核抗原，协同抑癌基因p53，加速癌细胞凋亡。    　　2组治疗后原发癌灶AI明显增高，从统计学上看，术前介入组要优于IAIC组；IAIC组在细胞凋亡上不如术前介入组明显，可能与IAIC的药物作用时间有一定的关系，术前介入化疗后平均7.5 d后接受手术，而IAIC灌注的化疗药物作用原发灶的时间仅仅是短短的几十分钟到数小时（即IAIC药物灌注结束到手术切下胃肿瘤标本这一段时间）。但IAIC能明显促进癌细胞的凋亡，IAIC灌注前、后有较强的相关性。如何提高IAIC的AI，笔者将对此做进一步研究。    　　通过动脉化疗，在光学显微镜下观察HE标本和细胞凋亡病理标本，发现原发癌灶和癌旁淋巴结癌细胞发生了显著的立即改变。IAIC组能够在80 min内，使大量肿瘤细胞变性、坏死，Ⅰ级2例、Ⅱ级9例、Ⅲ级7例，有效率达90%，与高登鹏等［11,19］报道的立即有效性91％、95%基本一致；而术前介入组Ⅰ级4例、Ⅱ级5例、Ⅲ级5例，有效率为93%，2组有效率比较差异无统计学意义（P＞0.05），充分说明IAIC能够利用高浓度大剂量抗肿瘤药物，促进药物的浓度依赖性、增加局部药物的浓度，提高破坏肿瘤细胞的能力，与术前介入化疗有等效的作用。    　　通过进展期胃癌IAIC的前瞻性研究，笔者认为进展期胃癌IAIC，靶向精确，近期效果良好，对减少和防止术中癌细胞的医源性扩散、种植及术后复发有重要的临床意义；同时通过基因蛋白表达和AI的检测，可大致了解所应用的化疗方案是否有效，通过进一步的研究有可能在抗肿瘤药物敏感试验上寻找到一条捷径，可望成为肿瘤个体化治疗的一个手段；与术前介入化疗相比，IAIC给药方便，操作简单，易于临床推广应用，可望成为进展期胃癌多模式治疗的重要组成部分；本研究样本量小，有待大宗病例进一步的前瞻性研究证实。【参考文献】[1] 季加孚.胃癌外科的现状与发展趋势[J].中国普外基础与临床杂志，2006，l3(l):1-3. 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