Cx43基因在肝细胞癌中的表达及意义

作者：王海琴 霍继荣 胡继雄 王赛    作者单位：中南大学湘雅二医院老年病科，湖南 长沙 410011

【摘要】  目的 探讨肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中Cx43基因的表达及其在HCC发生中的意义和机制。方法 应用Western印迹和RT-PCR方法分别检测Cx43蛋白和Cx43mRNA在26例HCC组织，22例癌旁组织和9例正常肝组织中的表达。结果 Cx43蛋白在HCC中的表达明显低于正常肝组织和癌旁组织(P＜0.05)；Cx43mRNA在HCC、癌旁组织和正常肝组织表达无显著差异(P＞0.05)。结论 Cx43蛋白的表达下调可能是HCC发生的重要环节之一，这可能与该基因在转录后翻译或翻译后蛋白质的加工修饰过程的调控异常有关.

【关键词】  细胞间隙连接通讯；连接蛋白43；肝细胞癌；蛋白质印迹法；逆转录聚合酶链式反应

　　肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，在肝癌中约有90%为肝细胞癌(HCC)，其发病分子机制尚不明确。HCC综合治疗方案需要补充新疗法，其中基因治疗被认为是很有前途的研究方向之一。间隙连接(GJ) 是并列细胞间的膜间连接结构，相邻细胞间通过间隙连接所介导的细胞间隙连接通讯(GJIC)进行着信息和能量物质的交换。大量研究发现肿瘤和转化细胞普遍存在GJ蛋白表达的异常和GJ通讯功能的缺陷〔1～3〕，GJ蛋白基因表现出肿瘤抑制基因的特点〔4〕。Cx43是一种主要的细胞间隙连接蛋白，Cx43表达减少或缺失与多种肿瘤的发生、发展有关，为此探索Cx43与HCC发生的关系和作用机制，为HCC的基因治疗提供新的理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  26例HCC标本来源于2001～2003年中南大学湘雅二医院外科手术切除标本，所有标本均经病理学证实为原发性HCC。其中男20例，女6例，年龄42～71（平均58±8.24）岁，22例取癌旁3～5 cm组织，为癌旁组织组。所有病例术前均未经过放疗和化疗。9例正常肝组织标本为1998～2003年本院外科外伤性肝破裂患者的手术切除标本，并除外其他肝脏疾病。其中男6例，女3例，年龄39～62(平均47±6.88)岁。应用蛋白质印迹法(Western blot) 和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别检测了26 例HCC，22例癌旁组织和9 例正常肝组织中Cx43蛋白及Cx43mRNA水平。

　　1.2  试剂和仪器  Cx43鼠抗人单抗(美国zymed公司)，Trizol（美国MRC公司），AMV逆转录试剂盒（Sigma公司），Cx43、β-actin PCR引物（上海博亚生物工程公司），Taq酶系统（大连宝生物工程公司），PE9600型PCR仪（美国Perkin Elmer公司），普通核酸、蛋白电泳及转膜设备（美国Bio-Rad 公司）。

　　1.3  方法

　　1.3.1  Western印迹分析  组织中提取总蛋白,将蛋白样品上样电泳，电泳完毕后，将膜上转有蛋白质Marker的泳道剪下做考马斯亮蓝染色，剩余膜放入封闭液中封闭1 h以上或过夜，将封闭好的膜转入杂交袋中，分别加入1∶500稀释的抗Cx43单克隆抗体和1∶2 500稀释的抗β-actin单克隆抗体，室温转轱2 h，用 PBS洗膜3次，每次15 min，将膜转入杂交袋中，加入稀释10 000倍的二抗，用封口机封好杂交袋，转轱2 h，用0.1% PBS洗3次，每次15 min，加显色液于膜上，反应5 min后，用透明胶固定在显影夹上于暗室中进行显影、定影。用Gel Dos 2000 成像仪测量各标本光密度OD值，得各标本Cx43含量。

　　1.3.2  RT- PCR  按照试剂说明书进行反转录和扩增,以β-actin为内对照。RT（逆转录）采用美国Promega公司AMT逆转录试剂盒，模板为提取总RNA，引物为Oligo(dT)15,逆转录酶为AMV反转录酶,根据GENEBANK中 Connexin43序列(NM-000165)，β-actin序列(NM)利用互联网上提供的在线软件Primer 3 Input设计引物。Cx43上游引物:5′-GGGTTAAGGGAAAGAGCGACC-3′，下游引物：5′-CCCCATTCGATTTTGTTCTGC-3′，扩增片段247 bp；β-actin上游引物：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，下游引物：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，扩增片段318 bp。

　　1.3.3  非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  取3 μl PCR产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳30 min后，再置入硝酸银溶液中染色10 min，以显色液显色。将凝胶置Genesnap 影像分析仪，照像并灰度扫描分析。获得各标本Cx43和β-actin PCR产物的OD值，然后求Cx43/β-actin PCR产物OD值的百分比。

　　1.4  统计学处理  用SPSS10.0统计软件包和Excel软件作统计学处理，对计量资料进行方差齐性检验，方差齐者，用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验总体均数差异性，有显著差异者再进行两两比较（Student-Newman-Keuls Test）。

　　2  结果

　　2.1  Cx43蛋白在HCC中的表达水平下降  按照蛋白浓度取50 μg总蛋白做免疫印迹,检测Cx43(43 kD)表达水平,结果HCC组织Cx43蛋白水平较正常肝组织和癌旁组织明显下降，见图1。9例正常肝组织OD值0.966±0.048,22例癌旁组织OD值1.114±0.125,26例HCC组织OD值0.127±0.037，经单因素方差分析，各组间差别显著（P＜0.05）。HCC组分别与正常肝组织和癌旁组织相比，其Cx43蛋白均明显降低（P＜0.01）。

　　图1  各组织Cx43蛋白Western印迹检测（略）

　　2.2  Cx43 mRNA在各组织中的水平比较  9例正常肝组织OD值0.997 2±0.082 5,22例癌旁组织OD值1.043 9±0.125 8,26例HCC组织OD值0.950 2±0.149 1，各组总体均数方差齐，组间差别不显著（P＞0.05）。表明HCC中Cx43mRNA水平与癌旁组织以及正常肝组织无明显差别。根据Cx43和β-actin的最佳PCR指数扩增期，以各组织的RT产物为模板分别对Cx43扩增30个循环,对β-actin扩增24个循环,为便于观察将产物点样同一道后,行6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，同时设未加模板的PCR产物为阴性对照，见图2。

　　1.正常肝组织  2.癌旁组织  3.HCC  4.阴性对照  M:Marker

　　图2  Cx43mRNA RT-PCR产物电泳图（略）

　　3  讨论    　　GJ是并列细胞间的膜间连接结构，由间隙连接蛋白(connexin Cx)构成，目前认为连接蛋白Cx基因家族是一抑癌基因家族，自1986年第一个Cx基因被克隆后，目前已发现该基因家族的20多个成员，Cx基因的正常表达对维持细胞正常生长、增殖和分化起重要作用。近来研究表明细胞恶性转化后普遍存在Cx表达下降。Cx43是一种主要的细胞连接蛋白。近来研究表明Cx43表达减少或缺失与多种肿瘤的发生、发展及转移密切相关，许多肿瘤细胞如神经胶质瘤、肾癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等均显示Cx43表达减少或缺失〔5～7〕，本研究也证实了Cx43在人类HCC中较癌旁组织及正常肝组织中表达水平明显降低，连接蛋白基因Cx43表达的降低可导致GJIC的减弱或消失，GJIC功能的缺陷使恶性化细胞逃离生长控制，在转移过程中逃避免疫监视,与HCC的形成密切相关，很可能是HCC形成的重要分子机制,故认为Cx43表达的减少可能是HCC多步骤癌变过程中的重要分子事件之一。    　　Laird〔8〕等研究了一系列乳腺癌细胞株、正常大鼠乳腺组织和大鼠乳腺肿瘤模型，在乳腺癌细胞株中Cx43mRNA水平下降，提示Cx43蛋白下降是转录抑制引起。另有研究发现人类卵巢细胞癌〔9〕、肺癌〔6〕及HCC〔10〕中Cx43mRNA水平与正常组织及癌旁组织相比未发现显著性差异，本实验结果和后者一致，是否不同肿瘤中Cx43在不同阶段调控异常有待进一步探讨。本实验观察到Cx43蛋白在HCC中明显降低，而Cx43mRNA水平无显著改变，提示HCC中Cx43蛋白缺失可能是Cx43基因在转录后的翻译或翻译后蛋白质的加工修饰过程异常相关，在HCC内信号转导初步研究中发现Cx43蛋白酪氨酸磷酸化作用与GJIC功能的抑制相一致〔11〕。磷酸化作用可使Cx43蛋白作为功能结构单位，并维持Cx43蛋白的数量，一旦磷酸化不能实现，Cx43蛋白装配成细胞表面功能性间隙连接斑(gap junction plaques)即受阻。本研究通过探索Cx43基因表达与HCC发病机制的关系，能否通过修复GJIC来抑制HCC，对HCC的基因治疗具有重要意义，有待进一步研究。

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