糖原合成酶激酶-3β及其磷酸化产物在难治性癫疒间患者颞叶前部的表达

糖原合成酶激酶-3β及其磷酸化产物在难治性癫疒间患者颞叶前部的表达作者：郭珍立    作者单位：430015 武汉,湖北省新华医院脑科中心神经内科    【摘要】  目的 探讨糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）及其磷酸化产物（p-GSK-3β）在难治性癫疒间（RE）患者颞叶前部的表达。方法 应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、实时荧光定量（FQ）PCR、免疫组化及免疫印迹法检测36例RE患者颞叶前部GSK-3β及其p-GSK-3β的mRNA和蛋白的表达，并与8例对照者进行比较。结果 RE患者脑内神经元及胶质细胞GSK-3β mRNA及蛋白表达明显增多（均Ｐ<0.05），p-GSK-3β表达明显减少（Ｐ<0.05）。结论 GSK-3β及其磷酸化产物表达异常，可能与RE的发生和发展有关。    【关键词】  癫疒间 难治性 糖原合成酶激酶-3β    Expression of glycogen synthase kinase-3β and its phosphorylated product in the anterior temporal neocortex in patients with refractory epilepsy 　　GUO Zhen-li, KE Xian-jun, YIN Hong-xiang, et al. 　　Department of Neurology, Center of Brain,Xinhua Hospital of Hubei Province,Wuhan 430015,China    Abstract：Objective  To investigate expression of glycogen synthase kinase（GSK）-3β and phosphorylation GSK-3β （p-GSK-3β） in the anterior temporal neocortex in patients with refractory epilepsy（RE）. Methods   Expression of GSK-3β and p-GSK-3β were detected by RT-PCR, FQ-PCR, Western Blot and immunohistochemistry in the anterior temporal cortices of 36  RE cases. 8 patients without RE had been used as the controls. Results  Compared with control group,the expression of GSK-3β mRNA and  protein  were significant higher（allP＜0.05） and p-GSK-3β was down-reuglated （P＜0.05） in the anterior temporal neocortex in RE group.  Conclusion  The abnormal expression of GSK-3β and p-GSK-3β may be indicated the pathologic role in RE.    Key words：refractory epilepsy；glycogen synthase kinase-3β    糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是多功能蛋白激酶［1,2］，涉及细胞发育、胞体形成及细胞骨架的完整性；同时参与易化转录因子-κB、降低核β-连环蛋白、高度磷酸化tau蛋白和微管相关蛋白1B等，导致神经元死亡和胶质细胞增生。本研究通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、实时荧光定量（FQ）PCR、免疫组化染色及免疫印迹法检测36例难治性癫疒间（RE）患者脑组织GSK-3β及其第9个位点磷酸化产物p-GSK-3β的表达水平，探讨其在RE发生中的作用。1  对象与方法　　1.1  对象 　　（1）癫疒间组：系2004～2006年本院和重庆医科大学附属第一医院神经外科行手术治疗的RE患者，符合国际抗癫疒间联盟1981年有关癫疒间发作分类标准，以及：①正规服用≥2种一线抗癫疒间药并且≥2年、血药浓度在有效范围内仍有发作；②头颅CT、MRI及相关实验室检查未发现其他神经系统疾病；③术前和术中脑电监测有明显的疒间性放电灶。男19例，女17例;年龄16 ～64岁，平均（22.6±10.1）岁；病程5～20年，平均（10±2.3）年。（2）对照组：同期本院神经外科行颅脑手术的脑外伤患者，男3例，女5例；年龄14～57岁，平均（23.4±14.2）岁。既往无癫疒间发作史及神经系统疾病史。　　1.2  方法　　1.2.1  标本收集及保存 　　将术中取出的颞叶前部脑组织（5 mm×8 mm）立即放入液氮罐（-80℃）中保存备用，另取同部位少量组织（5 mm×5 mm）用10％多聚甲醛固定48 h后常规石蜡包埋备用。　　1.2.2  RT-PCR 　　（1）RNA提取:取标本100 mg，在液氮中磨碎，加入含1 ml Trizol离心管中，12 000 r/min 离心5 min，取上清液加氯仿0.2 ml，充分振荡混匀后室温放置10～15 min；4℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清液至另一离心管中，加异丙醇0.5 ml 混匀，置-70℃ 冰箱15～30 min；4℃、12 000 r /min离心15 min，保留白色沉淀，加75%乙醇1 ml，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃、12 000 r / min离心10 min后弃上清，室温晾干，用50 μl的Rnase-free水溶解沉淀得到总RNA，-80℃ 存放待用。同时进行紫外线光定量，用甲醛变性电泳鉴定RNA 的质量。（2）RT-PCR:总RNA 用mRNA柱纯化试剂盒（Boistar公司）纯化个体样品 mRNA，逆转录生成cDNA。上游引物5′-GGAAGGAAGGAAGCGAGGAG-3′，下游引物5′-AGATCGCGAGTCAGTCAGAGG-3′。 选择PHLDA作为管家基因：上游引物5′-TGAAGG-TCGGAGTCAACGGA-3′， 下游引物5′-CATGTGGG-CCATGAGGTCCA-3′。反应条件：预变性94℃ 2 min;变性94℃ 30 s，退火57℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，共 28个循环;最后延伸72℃ 7 min。（3）产物鉴定:　取5 μl PCR 产物在1.5% 琼脂糖凝胶上、100 V 电泳20 min后进行图像分析，计算待测基因与PHLDA光密度的比值（GSK-3β/PHLDA,p-GSK-3β/PHLDA）。　　1.2.3  FQ-PCR 　　样本总 RNA提取、cDNA合成及引物同前，选择18s rRNA作为管家基因。在PCR反应体系中，加入过量的荧光染料SYBR。反应体系为25 μl，包括SG Master 12.5 μl、引物各0.5 μmol/L、ROX阳性对照染料0.54 μl、dH2O 9 μl和2 μl DNA膜板。将反应体系置于Rotor-Gene 3000型离心式实时定量PCR仪（Corbett Research公司）按下列条件扩增：94℃ 2 min预变性，然后94℃ 10 s变性，61℃ 30 s退火，72℃ 20 s 延伸，共40个循环。样品管均设3个重复管。在每一循环的退火温度时收集荧光进行实时检测，得到标本的所有记录点曲线，调整基线循环和计算域值后，得出Ct值，样品的相对定量采用目的基因测得值除以18s rRNA内参值以校正误差，所得结果为样品目的基因GSK-3β mRNA的丰度。　　1.2.4  HE染色 　　颞叶前部少量脑组织石蜡包埋后做4 μm厚切片， HE染色、封片后显微镜下观察组织病理学变化。　　1.2.5  免疫组化染色 　　抽取颞叶脑组织标本石蜡块切片常规脱蜡，3％H2O2室温反应5 min，pH 6.0柠檬酸缓冲液冲洗2～3次，山羊血清封闭30 min，滴加一抗［GSK-3β，p-GSK-3β（ser9）滴度均为1∶100］，37℃放置2 h；加生物素标记二抗，室温30 min；加链酶卵白素-辣根过氧化物酶，室温30 min；DAB显色15 min，苏木素复染、脱水与烤干封片。PBS代替一抗、二抗作阴性对照。切片中见棕黄色颗粒为GSK-3β，p-GSK-3β阳性。采用北航CM-2000B型生物医学图像分析系统对切片进行分析。　　1.2.6  免疫印迹法 　　液氮保存的脑组织经PBS充分洗涤、匀浆、沸水浴变性后，超声断裂DNA，离心得到含总蛋白上清液。以β-actin作内参，按总蛋白含量计算每个样本上样量，使每个电泳孔道上总蛋白量相同。以8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶分离胶置于转移液中10 min，将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。室温封闭2 h，滴加一抗稀释（滴度GSK-3β 1∶200，p-GSK-3β 1∶300），4℃过夜，TBST洗15 min ×3次，加HRP标记二抗,室温作用2 h，TBST洗15 min ×3次，用DAB法显色，彩虹maker确定目的蛋白条带；Image pro plus 5.0软件分析各蛋白条带。　　1.2.7  统计学方法 　　数据以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 10.0 软件，组间比较t检验。2  结  果　　2.1  两组GSK-3β mRNA表达的比较 　　癫疒间组GSK-3电泳条带较对照组明显增宽，信号明显增高（图1）；癫疒间组GSK-3β mRNA/PHLDA比值与对照组比较差异有统计学意义（Ｐ<0.05）。　　2.2  两组脑组织病理学变化 　　癫疒间组18例胶质细胞增生，22例神经元丢失，其中4例同时有上述两种病理改变；对照组未见明显的病理学改变。　　2.3  两组GSK-3β和p-GSK-3β阳性细胞的比较 　　见图2、表1。免疫组化显示GSK-3β和p-GSK-3β主要分布于神经元胞体， 与对照组比较，癫疒间组颞叶前部GSK-3β表达明显升高，p-GSK-3β表达明显下降（均Ｐ<0.05）。表1  两组患者脑组织GSK阳性细胞OD值的比较（略）注：与对照组比较△Ｐ<0.05；OD1为免疫组化结果，OD2 为免疫印迹结果3  讨  论    GSK-3β内含420个氨基酸，第9位丝氨酸磷酸化引起酶活性抑制，第216位丝氨酸磷酸化致酶激活，其功能异常将引起tau蛋白异常磷酸化、神经元凋亡和轴突转运障碍［1］，这些都是癫疒间患者脑部常见的病理改变［4,5］。本研究通过对RE患者脑组织检测发现，GSK-3β mRNA 及其蛋白在颞叶前部表达明显增加，p-GSK-3β蛋白明显减少，免疫印迹结果与免疫组化检测结果一致。    GSK-3β在体内的功能活动是通过激活和失活两个方面来调节的。本研究发现不仅GSK-3β的mRNA表达上调，蛋白产物增多，而且还有分解失活的GSK-3β减少，这两个方面的异常共同促进了癫疒间患者脑内GSK-3β的活性增加。    癫疒间患者脑内存在抗癫疒间和致癫疒间系统，当各种因素引起致癫疒间系统占优势时，可导致神经元损伤，神经元网络重建，临床上表现为癫疒间的反复发作。癫疒间动物模型和RE患者脑组织中有多种信号因子的表达增强，如胰岛素、表皮生长因子（EGF） 、成纤维细胞生长因子（FGF） 和Wnt 配体, 这些物质经蛋白激酶、P90RSK信号传导途径，可使GSK-3β第9位丝氨酸发生磷酸化而失去生物学活性［6,7］，减少GSK-3β对神经元的损伤；当GSK-3β表达升高，失去生物活性的p-GSK-3β表达下调， GSK-3β功能活跃，导致癫疒间频繁发作。因此，GSK-3β在RE的发病机制中可能起着重要作用，应用外源性GSK-3β抑制剂，有可能成为一个RE治疗的新途径。    癫疒间频繁发作导致的神经元丢失和胶质细胞增生是RE突出的病理特征［8,9］。本研究发现61.1％的患者出现神经元丢失，50％胶质细胞增生。GSK-3β有多种磷酸化底物，如丙酮酸脱氢酶、蛋白磷酸酯酶抑制因子2、胰岛素受体底物Ⅰ等代谢和信号蛋白，参与糖原合成、胰岛素调节、多种蛋白转录激活和发育调控等许多生命活动的信号转导和多种生物学过程［1,2,10-13］；其表达异常将影响神经元存活和胶质细胞增生，而神经元坏死及随之而来的胶质细胞增生将导致病理性神经网络重组和兴奋性突触环路重建，引起RE的产生［8,9,14,15］    总之， GSK-3β mRNA和蛋白在耐药性癫疒间患者颞叶前部中表达升高，其代谢产物p-GSK-3β表达降低，这种异常表达可能通过多条途径影响神经元存活和可塑性以及胶质细胞增生，导致癫疒间反复发作。通过降低GSK-3β的表达有可能为人类防治RE提供一个新靶点。【参考文献】　　［1］Lucas JJ, Hernandez F,Gomez-Ramos P,et al. 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