低氧预适应对移植肝内胆管的显微及超微结构的影响

    作者：张培建　周斌　金成　李勇　田田　冯敏　刘新颜　卜平    作者单位：扬州大学医学院　外科教研室

    【摘要】  目的：探讨移植肝内胆管的显微和超微结构的变化以及低氧预适应的保护作用。方法：建立大鼠自体原位肝移植模型，30只SD大鼠随机分为3组，A组：自体原位肝移植组； B组：低氧预适应后行自体原位肝移植组； C组：假手术组。术后48 h取材，检测各组血清胆红素水平，光学显微镜下观察各组胆管上皮细胞的显微结构，透射电子显微镜下观察肝内毛细胆管的超微结构。结果：A组血清胆红素水平比B组升高更明显（P<0.01）；光学显微镜下，A组与B组相比，胆管上皮细胞损伤严重，细胞排列缺失明显，炎性细胞浸润增加；电子显微镜下，A组与B组相比，肝内毛细胆管管腔扩张明显，微绒毛肿胀、数量减少或消失的情况严重，胆汁淤积程度明显。结论：低氧预适应对移植肝内胆管具有显著的保护作用。

    【关键词】  细胞低氧·移植物·胆管，肝内·显微结构·超微结构

    Effect on the micro- and ultramicro-structure of intrahepatic bile duct mediated by hypoxic preconditioning after liver graft

    ZHANG Pei-jian, ZHOU Bin, JIN Cheng, LI Yong, TIAN Tian, FENG Min, LIU Xin-yan, BO Ping

    Institute of General Surgical Research, Medical College of Yangzhou University （Yangzhou 225001, China）

    【ABSTRACT】 Objective: To investigate the change of the micro- and ultramicro-structure of intrahepatic bile duct after liver graft and the protection of hypoxic preconditioning. Methods: The model of orthotopic autologous liver transplantation was used, thirty SD rats were randomly divided into three groups. A: orthotopic autologous liver transplantation group; B: hypoxic preconditioning before operation group; C: sham operation group. The serum bilirubin ,the micro-structure of biliary epithelial cell and the ultramicro-structure of cholangiole were determined in three groups after 48

    hours after operation. Results: As compared with B group: the serum bilirubin increased（P<0.05）; the biliary epithelial cell was damaged and inflammatory cell infiltrated; the cholangiole was distended, microvilli were swelled the degree of cholestasis were more obviously in group A. Conclusion: The micro- and ultramicro-structure of intrahepatic bile duct after liver graft were protected by hy

    　　肝移植术后胆道并发症发生率高达5.8％~35％，是肝移植后居第2位的主要并发症［1］，严重影响肝移植受者术后生活质量、导致移植物丧失甚至患者死亡［2］。非致死性低氧预适应（hypoxic preconditioning，HP）的大鼠脑组织损伤明显减轻，这种内源性保护现象也存在于肝、肾等多种组织器官［3-4］。本研究通过观察HP对移植肝内胆管显微及超微结构的影响，来探讨HP对其的保护作用。

    1　材料与方法

    1.1　实验动物及分组　SD大鼠30只（扬州大学动物实验中心提供），10～12周龄，体质量200～250 g。随机分为3组，每小组10只。A组：自体原位肝移植组；B组：术前行8%氮氧混合气体的低氧预处理90 min［5］，然后行自体原位肝移植；C组：假手术组，仅行开腹，分离肝门部即关腹。各组于术后48 h迅速取材。

    1.2　动物模型的制备　大鼠自体原位肝移植参照赵宏峰等［6］的模型并进行改进，具体步骤如下。1）乙醚半开放式面罩吸入麻醉，术前10 min肌肉注射阿托品0.03 mg，仰卧位固定。2）取正中切口进腹，进腹后逆时针游离肝周韧带。然后游离肝上腔静脉（suprahepatic vena cava, SVC）、肝下腔静脉（inferior vena cava, IVC）。解剖第一肝门，游离肝动脉，从肠系膜下静脉和脾静脉汇合处游离门静脉（portal vein, PV）至肝门部，并将PV壁鞘膜分离干净。3）在肠系膜上静脉及脾静脉汇合处上无损伤血管夹，轻轻向上向后提起血管夹，用4号针头刺入PV,并用无损伤血管夹固定穿刺针，推入肝素盐水约3 mL，使肝脏内的血液进入体循环，准备进行冷灌注。4）冷灌注前分别在肝动脉、SVC、IVC上无损伤血管夹，并在IVC血管夹稍上方静脉壁剪开约1 mm缺口作流出道。然后经PV穿刺处灌注4 ℃含肝素的乳酸林格液，在灌注的同时不断用4 ℃乳酸林格液浇注肝脏表面降温。直至肝脏逐渐变成土黄色时停止灌注。5）灌注完成后拔出穿刺针，用prolene缝线修补PV穿刺点和IVC流出道，并预松血管夹查看修补是否成功，成功后分别松开PV、SVC、IVC及肝动脉的无损伤血管夹，使肝脏复流，结束无肝期。同时用38 ℃生理盐水20 mL浇注肝脏表面以快速复温。6）关腹，38 ℃恒温箱清洁饲养。

    1.3　观测指标及方法　1）心脏取血以全自动生化分析仪测定血清总胆红素（total bilirubin， TBIL）、直接胆红素（direct bilirubin， DBIL）和间接胆红素（indirect bilirubin, IBIL）。2）肝内胆管的显微结构：动物取血后立即处死，迅速切取肝左叶，取5 mm×10 mm大小置于10%的中性甲醛固定，常规石蜡包埋制片，HE染色，光学显微镜观察并采集图像。3）肝内毛细胆管的超微结构：动物取血后立即处死，迅速切取肝左叶，取1 mm×1 mm大小，2%戊二醛、1%锇酸固定后，逐级乙醇脱水、环氧乙酸置换、浸透、包埋，超薄切片、铀酸染色，透射电子显微镜观察并采集图像。

    1.4　统计学处理　采用SPSS10.0统计软件包进行分析，实验数据用x±s表示，独立样本t检验比较两组间均数的差异，单因素方差分析比较多组间均数的差异。P≤0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　胆红素水平　与C组相比较，A组与B组都有不同程度的升高，A组比B组升高更明显（P<0.01）；其中以A组DBIL升高较其他两组明显（P<0.01），且B组与C组相比差异无统计学意义，各组IBIL变化不明显（P＞0.05，表1）。

    2.2　肝内胆管上皮细胞显微结构变化　C组肝内胆管上皮细胞在光学显微镜下呈柱状，排列整齐；细胞核位于基底部，无炎症细胞浸润，管腔内无或少有脱落坏死的上皮细胞。A组可见胆管上皮细胞排列紊乱、有缺失；细胞肿胀明显，形态多样，部分呈立方状或柱状；细胞核内染色质边集，部分细胞出现核分裂；胆管上皮细胞周围炎症细胞浸润明显，管腔内可见坏死脱落的细胞碎片。B组肝内胆管上皮细胞损伤程度较A组明显减轻（图1）。

    2.3　肝内毛细胆管超微结构变化　C组肝内毛细胆管壁实际由肝细胞的界膜作局灶性分隔而形成，管腔直径约1 μm，其间无细胞器，腔内见散在分布微丝结构和丰富的微绒毛突起，部分微丝可延伸至胆管微绒毛中。A组毛细胆管腔明显扩大，其中的微绒毛肿胀、减少或缺失；毛细胆管腔内胆汁淤积明显，颗粒成份增加。B组毛细胆管腔未见扩大，微绒毛丰富，肿胀不明显；管腔内无明显胆汁淤积的表现，颗粒成份较少（图2）。

    3　讨论

    　　本研究采用自体原位肝移植模型，很好的模拟了原位肝移植过程中胆管经历的缺血再灌注损伤（ischemia and reperfusion injury, IRI）。另外本模型与大鼠异体原位肝移植相比不切断出入肝的血管，避免了血管吻合，降低了手术难度，并且自体移植完全排除了免疫排斥方面的影响，能够更直接、更客观地反映IRI对肝内胆管的损伤作用［6］。随着对胆道并发症认识的深入和外科吻合技术的提高，由外科技术原因造成的胆管吻合口并发症及引流管相关并发症的发生率呈下降的趋势，而非外科技术因素所导致的以移植物胆管树损害为主要特征的供体胆管并发症则成为术后胆管并发症的主要类型。一般认为，IRI是导致非外科性移植物胆管树损害最重要的始动因素之一［7］。有研究表明，HP可以通过促使线粒体在低氧状态下糖酵解供能增加，改善移植术后的肝脏微循环，从而提高肝细胞对肝移植时较严重的IRI耐受力，提高移植术后的存活率［8］。

    　　毛细胆管由相邻肝细胞的毛细胆管面构成，是胆汁形成和分泌的主要场所，由毛细胆管形成和分泌的胆汁约占每日胆汁形成和分泌总量的75%。已有研究指出，毛细胆管是肝脏中最容易遭受IRI的结构之一［9］，再灌注后肝细胞毛细胆管面可发生显著的形态学改变。陈耿等［7］在移植肝门静脉血流恢复后60～90 min取得的标本中，见毛细胆管明显扩张，呈静脉曲张样改变，微绒毛消失，同时伴随周围微丝结构的改变和胆汁分泌的减少。本研究同样显示，肝内毛细胆管经历了自体原位肝移植IRI后，通过透射电子显微镜观察可见毛细胆管腔扩张明显，微绒毛肿胀、减少或缺失；毛细胆管腔内胆汁淤积明显，颗粒成份增加。而经过低氧预处理后行自体原位肝移植组，肝内毛细胆管腔未见明显扩大，微绒毛丰富，肿胀不明显；管腔内无明显胆汁淤积，颗粒成份较少。同时，术后的血清胆红素指标显示，与B组相比，A组血清胆红素水平较C组升高更明显，其中以DBIL升高为主（P<0.01）。两者结合均提示经过低氧预处理后，肝内毛细胆管的功能得到了很好的保护，术后胆汁淤积程度明显减轻。继而减轻了肝内胆管在肝移植过程中所经历的IRI，减少了非外科技术因素所导致的胆管并发症。

    　　由于肝内胆管仅由肝动脉供血，故胆管上皮细胞应该是一类高氧耗、高代谢、低缺氧耐受、易受损的细胞群体。胆管上皮细胞内缺乏过氧化氢酶、过氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽等抗氧化的酶系，因而较肝细胞更易受到IRI时氧自由基的损伤［10］。Elimadi等［11］的研究提示，再灌注后小叶间胆管上皮细胞损伤明显，包括胆管直径变小、上皮平均面积及微绒毛数量减少，甚至引起胆管上皮细胞干裂、脱落，出现黏膜全层坏死或穿孔，坏死后纤维组织增生而致狭窄，这是肝移植术后非吻合性胆管狭窄的重要原因。本研究显示，肝内胆管上皮细胞经IRI光学显微镜下可见细胞排列紊乱，有缺失；细胞肿胀明显，形态多样，部分呈立方状或柱状；细胞核内染色质边集，部分细胞出现核分裂；细胞周围炎症细胞浸润明显，管腔内可见坏死脱落的细胞碎片。而经过HP后行自体原位肝移植组，胆管上皮细胞损伤程度明显减轻。说明HP对移植肝内胆管上皮细胞具有显著的保护作用，可以预防和减轻肝移植术后非吻合性胆管狭窄。但HP对其保护作用的确切机制有待于进一步研究。

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