血小板β淀粉样肽前体蛋白免疫强度及异构体比率对Alzheimer病的诊断价值
发表时间：2010-01-28 浏览次数：652次
血小板β淀粉样肽前体蛋白免疫强度及异构体比率对Alzheimer病的诊断价值作者：薛寿儒，杨小旺 作者单位：215006苏州大学附属第一医院神经科 【摘要】 目的 探讨血小板β淀粉样肽前体蛋白（APP）免疫强度及异构体比率对Alzheimer病( AD )的诊断价值。方法 应用流式细胞术和Western Blot方法分别检测31例 AD患者、22例血管性痴呆(VD)患者、28例神经变性病患者及30名健康老年人血小板APP免疫强度和APP异构体比率。结果 APP免疫活性各组间差异无统计学意义；APP130/APP106比率AD组明显低于VD组、神经变性病组和健康老年组（均P<0.05)；AD组APP130/APP106比率与其简易智力状态量表（MMSE）评分呈正相关（r=0.607, P<0.01)。结论血小板APP异构体比率降低可用于临床对AD的诊断。 【关键词】 Alzheimer病;β淀粉样肽前体蛋白;血小板 Diagnostic value of the immune intensity of platelet βamyloid precursor protein and isoforms proportion for Alzheimers disease XUE Shouru，YANG Xiaowang.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou 215006, China Abstract：Objective To explore diagnostic value of the immune intensity of platelet βamyloid precursor protein(APP) and isoforms proportion for Alzheimers disease(AD).Methods The APP immune intensity of platelets was evaluated by flow cytometric detection and the isoforms proportion of APP130/APP106 was also detected by Western Blot analysis in 31 AD cases, 22 vascular dementia (VD) patients , 28 neural degeneration patients and 30 healthy elders.Results There was no significant difference of APP immunity in the each group. The ratio of APP130/APP106 was significantly lower in the AD group compared with the groups VD， degenerative disorder and healthy elders(all P<0.05). There was positive correlation between the ratio of APP130/APP106 in AD patients and score of the Minimeatal state examination (MMSE) (r=0.607, P<0.01). Conclusion The isoforms proportion degrade of platelet APP can be used for diagnosis AD. Key words： Alzheimers disease;βamyloid precursor protein;platelet Alzheimer 病（AD）是中枢神经系统退行性疾病，其主要病理特征是胞外老年斑和胞内神经原纤维缠结以及血管壁β淀粉样蛋白（Aβ）沉积;临床表现为认知功能进行性损害［1］。老年斑以Aβ沉积为核心，Aβ是由其β淀粉样肽前体蛋白（APP）经过β和γ分泌酶介导的蛋白裂解而成。APP mRNA在哺乳动物中枢神经系统和周围组织［2］中广泛表达。血液循环中的血小板是表达并分泌APP的主要来源［3，4］，血小板表达3种APP异构体：APP695、APP751、APP770，相对分子质量（106～130）×103。国外报道［5，6］血小板APP异构体比率（APP130/APP106）异常可作为辅助诊断AD的重要生物指标之一。本研究通过病例对照的方法探讨外周血液循环中的血小板APP免疫强度及异构体比率，以及其与患者认知功能的关系，探讨其对AD诊断价值。1 对象与方法 1.1 对象 （1）AD组：系2001年1月～2005年12月本院住院及门诊根据美国NINCDSADRDA诊断标准符合“很可能AD”的患者31例，男14例，女17例；年龄55～92岁，平均（73.1±9.4）岁；病程8～21个月，平均（12.1±6.3）个月；平均受教育（7.8±3.6）年；简易智力状态量表（MMSE）评分为（12.8±5.6）分；Hachinski缺血量表（HIS）评分≤4分。（2）血管性痴呆（VD）组：系同期本院就诊并符合美国精神病学会制定的精神障碍诊断和统计手册第3版修订版（DSMⅢR）诊断标准的VD患者22例，男12例，女10例；年龄57～86岁，平均（71.9±8.5）岁；病程9～24个月，平均（13.7±6.5）个月；平均受教育（8.4±3.1）年；MMSE（13.9±4.7）分；HIS≥7分。 （3）神经变性病组：系本院同期神经内科病房神经变性病（包括帕金森病、运动神经元病和多系统变性病等）患者28例，男15例，女13例；年龄60～81岁，平均（69.4±8.7）岁；病程7～24个月，平均（12.3±7.2）个月；平均受教育（9.4±5.1）年；MMSE≥28分。（4）健康老年组：本院同期体检者30名，男16例，女14例；年龄58～79岁，平均（70.1±4.9）岁；平均受教育（6.9±4.1）年；MMSE≥28分；无神经系统疾病；头颅CT或MRI证实无脑萎缩和脑梗死。入组者测试前均停服影响血小板功能的物药和胆碱酯酶抑制剂1周。 1.2 方法 1.2.1 血小板APP免疫强度检测 采用流式细胞术，抽取入组者外周血1 ml按9∶1注入枸橼酸钠抗凝管混匀，离心5 min，获取血小板悬液，加PBS洗1次，倒干残液，转入Falcon管中，加入FITC抗人IgG（Duko公司）混匀，20℃暗处孵育20 min；加入1 ml 1%多聚甲醋固定液混匀，4℃暗处放置30 min，24 h内在FC500流式细胞仪（美国BeckmanCoulter公司）以单抗22C11（由Dr.Li赠送）标记血小板群，检测标本阳性率和荧光强度，采用血小板与阳性血清孵育作为阳性对照，设置抗鼠IgG（Duko公司）为空白对照。各管平均荧光强度与空白对照的比值作为血小板APP的相对表达量。 1.2.2 血小板APP异构体比率检测 采用免疫沉淀SDSPAGE及Western Blot电泳，抽取入组者外周血5 ml注入枸橼酸钠抗凝管，采用EDTA液收集细胞，加细胞裂解缓冲液，0℃超声匀浆30 s，4℃、10万 r/ min离心60 min，取上清液并移至Eppendof管中，加入单克隆抗APP抗体22C11，4℃摇匀4 h；加Protein Aagrose 4℃过夜，12000 r/ min离心30 min，弃上清，Tris（pH 7.4）缓冲液洗涤3次。在最终得到沉淀中加入2×上样缓冲液，95℃加热10 min，12000 r/ min离心30 min，取上清，置另一Eppendof管中。采用Tris/Tricine系统进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），每孔加样50 μl，电泳参数：50 V，30 min；电泳后凝胶移至转移缓冲液中，按规定顺序将凝胶、PVDF膜放置转移槽中，电转移参数：80 V,1.5 h。取出PVDF，做上记号，依次进行封闭1 h（封闭液:脱脂奶粉和TBS），洗涤，一抗（22C11 1∶1000，封闭液稀释）室温孵育2 h；HRP标记兔抗鼠IgG孵育1 h；按试剂盒指导用ECL系统检测PVDF标记的蛋白质，由Mac BAS 1.01软件程序对X线胶质上的APP印迹条带强度进行定量分析。 1.2.3 统计学方法 数据用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用F分析，Pearson分析组内相关性。2 结果 2.1 各组血小板APP免疫强度的比较 见表1。血小板APP含22C11抗体阳性率及相对表达量在各组间差异无统计学意义（F=1.55、1.06,P>0.05）。 表1 各组血小板APP免疫强度的比较（略） 2.2 各组APP130/APP106的比较 AD组、VD组、神经变性病组和健康老年组的APP130/APP106分别为0.66±0.18、1.01±0.09、1.2±0.12 、1.21±0.08 。AD组APP130/APP106明显低于VD组、神经变性病组和健康老年组（F=3.27,均P<0.05）。VD组、神经变性病组和健康老年组间比较差异无统计学意义（F=0.92,P＞0.05）。 2.3 各组APP130/APP106与MMSE评分、年龄和受教育年限间的关系 AD组APP130/APP106与其MMSE评分呈正相关（r=0.607，P<0.01)，与年龄、受教育年限不相关（r=0.203、－2.07，均P＞0.05）。而VD组、神经变性病组和健康老年组APP130/APP106与年龄呈负相关（r=－0.512、－0.619，P<0.05～0.01)，与受教育年限不相关（r=－0.142、－0.209，均P＞0.05）。3 讨论 APP既存在于中枢神经系统的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，也在外周组织表达，如肌细胞、上皮细胞和循环细胞。APP异构体如APP695、APP770等被证实存在于脑脊液、血液和尿液中［2，3］。血小板膜APP的构成与中枢神经系统APP相似，两者的区别在于mRNA和蛋白水平：中枢APP缺乏Kuitz型蛋白酶抑制剂（KPI）域，主要存在形式是APP695，而血小板APP包含 KPI域，存在形式以APP770为主。本研究结果显示AD组、VD组、神经变性病组和健康老年组22C11标记的APP免疫活性均在血小板上表达，各组间差异无统计学意义。推测其原因可能与上述各组包含3种APP异构体表达量不同有关［4］。 近来的研究［3］认为血小板在α和β等各种分泌酶作用下生成不同的APP并贮存在血小板α颗粒中。当血小板被激活后，各种APP成分和Aβ被释放出来，其中部分通过血脑屏障沉积在脑组织血管壁和细胞外，导致神经细胞外部分老年斑的产生［3，6］。因此，研究外周血小板APP成分能够为研究AD发病机制和治疗提供线索。 Zubenko等［7］的研究发现，AD患者存在血小板膜可塑性和细胞骨架异常；实验室研究［4］也证实AD患者血小板APP的代谢以及不同相对分子质量成分出现异常。本研究结果显示AD组APP130/APP106明显低于VD组、神经变性病组和健康老年组(均P<0.05），并与其MMSE评分呈正相关(P<0.01)。因此，AD患者血小板APP加工异常导致APP130/APP106降低，反映了AD患者脑部APP的变化。故根据血小板APP异构体比率的变化应用于AD和VD的鉴别，可能具有一定的临床意义。【参考文献】 ［1］丁新生.重视Alzheimer病的诊治［Ｊ］.临床神经病学杂志,2005,18:241. ［2］Padovani A, Borroni B, Colciaghi F,et al. 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