巨噬细胞在骨髓干细胞动员促深静脉血栓溶解中的作用

    作者：孙浩 陈以宽    作者单位：1重庆市第三人民医院　普外科　（重庆　400014）2重庆医科大学附属第二医院　普外科　（重庆　400010）

    【摘要】  目的：探讨骨髓干细胞动员对深静脉血栓中巨噬细胞密度和功能的作用。方法：SD成年大鼠随机分为假手术组、血栓组和rhG-CSF组。分析术后第7、14天血栓中巨噬细胞密度变化并在电子显微镜下观察血栓中巨噬细胞的功能。结果：rhG-CSF组血栓中巨噬细胞密度明显增加，与血栓组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。巨噬细胞吞噬功能活跃，溶酶体和吞噬体增多，常见新生幼稚血管和成熟再通血管。结论：骨髓干细胞动员增加了血栓中巨噬细胞密度，增强了其功能，促进了血栓溶解吸收过程。

    【关键词】  骨髓祖代细胞·静脉血栓形成·巨噬细胞

    Effect of macrophages on mobilizing bone marrow stern cells to promote thrombolysis in deep vein

    SUN Hao1, CHEN Yi-kuan2

    1Department of General Surgery, the Third People Hospital of Chongqing（Chongqing 400014, China）

    2Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University （Chongqing  400010, China）

    【ABSTRAT】 Objective: To discuss the effect of bone marrow stem cell mobilization on density and function of macrophages in deep vein thrombosis. Methods: Adult SD rats were divided randomly into sham operation group, thrombus group and rhG-CSF group. Analyzed the density change of macrophages in thrombus on the 7th and 14th day after operation and observed the function of macrophages in thrombus by electron microscope. Results: Density of macrophages in thrombus significantly increased in rhG-CSF group, compared with that in thrombus group（P＜0.05）. Macrophage phagocytic function was active, lysosomes and phagosomes increased, neonatal immature blood vessels and mature recanalized blood vessels were common. Conclusion: Bone marrow stem cell mobilization increases the density of macrophages in thrombus, enhances the

    function of macrophages in thrombus, promotes the process of thrombolysis and the absorption of thrombus.

    【KEY WORDS】 Myeloid progenitor cells·Venous thrombosis·Macrophages

    深静脉血栓形成（deep vein thrombosis, DVT）是血管外科常见疾病，目前国内外仍然以非手术治疗为主［1-2］，促进血栓的早期溶解和吸收有助于血栓的治疗。机体内静脉血栓的最终吸收和溶解主要是依赖于机体本身的慢性自然溶解机制，即是血栓的机化过程。在人体和动物静脉血栓的实验中发现：血栓的再血管化主要出现在巨噬细胞密度较高的区域［3］。Misao等［4］研究发现骨髓动员可增加心肌梗死区骨髓来源的巨噬细胞的聚集。本研究通过骨髓干细胞动员，探讨其是否能对大鼠深静脉血栓中巨噬细胞密度和功能有促进作用，从而加快血栓的溶解、吸收过程。

    1　材料与方法

    1.1　实验动物及分组　选用清洁级成年雄性SD大鼠40只，8周龄，体质量（250±10） g，由重庆医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为假手术组、血栓组和重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rhG-CSF）组。假手术组8只，血栓组和rhG-CSF组各16只。

    1.2   主要试剂与仪器　小鼠抗大鼠CD68单克隆抗体（Lab Vision公司）；山羊抗小鼠IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。生物医学图像分析系统（北航CM-2008B型）；OLYMPUS CH型光学显微镜（日本）；透射电子显微镜H-600型（HITACH公司）

    1.3　下腔静脉血栓模型的建立　参照文献[5]的方法并加以改进。血栓组SD大鼠在新环境下适应性喂养1周后，采用10%水合氯醛腹腔内麻醉（350 mg/kg），取仰卧位，四肢外展固定，腹部皮肤消毒，正中切口进腹。显露左肾静脉以下下腔静脉并结扎其属支，用神经血管钳阻断下腔静脉1 min，松开30 s，再阻断1 min，顺下腔静脉放置注射针头1根，以4-0丝线于左肾静脉下方结扎下腔静脉和针头，取出针头，缝合腹壁。术后动物自由饮水，正常饲养，不用抗生素，均成活。

    假手术组大鼠下腔静脉未行缩窄及阻断，余处理同血栓组。rhG-CSF组为模型鼠术后连续7 d在腹部皮下注射rhG-CSF（25 μg/kg），假手术组和血栓组同时在腹部皮下注射等量生理盐水。

    1.4　标本获取　术后第7、14天，以水合氯醛麻醉，经原腹部切口打开腹腔，解剖下腔静脉，将血栓组和rhG-CSF组形成血栓的一段下腔静脉连同其内部的血栓一同切下，放于4%多聚甲醛中固定。近心段用于免疫组织化学观察，远心段用于电子显微镜超微结构观察。

    1.5　免疫组织化学染色与结果判定　石蜡包埋标本，间隔50 μm连续切片3张。切片常规脱蜡和水化，抗原修复，滴加1% BSA封闭液，甩去多余液体。滴加的一抗为稀释的小鼠抗大鼠CD68单克隆抗体（1﹕100），37 ℃、1 h左右。PBS（pH=7.6）冲洗2 min/次×3次。滴加HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温20 min。PBS（pH=7.6）冲洗2 min/次×3次。滴加SABC，室温20 min。PBS（pH=7.6）冲洗5 min/次×4次。DAB显色，苏木精轻度复染。脱水、封片，400倍光学显微镜下观察。

    结果判定：细胞质呈棕黄色染色为巨噬细胞CD68阳性染色。图像分析系统测定血栓中阳性细胞的面积和血栓总面积，计算二者的比值，算出3张切片的平均百分数，即为该标本的巨噬细胞密度。

    1.6　超微结构观察　远心段固定的组织由重庆医科大学电镜室处理，血栓组和rhG-CSF组各取8例标本。主要经脱水、浸透、环氧树脂包埋、切片、定位、电子染色，切片于H-600型透射电子显微镜下观察。

    1.7　统计学处理　采用SPSS10.0统计软件包进行分析，数据以x±s表示，组间比较采用Dunnett-t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　血栓中巨噬细胞密度　假手术组术后无血栓形成，另2组静脉血栓中巨噬细胞CD68免疫组织化学染色为阳性（图1）。术后第7天，血栓组巨噬细胞CD68标记稀疏，巨噬细胞数量极少，未见新生血管；rhG-CSF组巨噬细胞CD68标记明显增多，可见较多新生血管，主要位于血栓内巨噬细胞集聚的区域。术后第14天，血栓组巨噬细胞数量仍较少，但新生毛细血管出现；而rhG-CSF组巨噬细胞和新生血管数量则更多，同时在血栓内部也有较多标记CD68的巨噬细胞和新生血管。图像分析系统结果显示：术后第7天，血栓组血栓中巨噬细胞密度为（1.57±0.82）%，rhG-CSF组为（8.58±1.24）%，2组间比较差异有统计学意义（P=0.003 7）。术后第14天，血栓组和rhG-CSF组血栓中巨噬细胞密度分别为（5.62±1.07）%和（14.52±1.32）%，差异亦有统计学意义（P=0.007 9）。

    2.2　电子显微镜观察结果　术后第7天血栓组血栓中巨噬细胞数量稀少，周围少见新生血管；术后第14天出现大量胶原，巨噬细胞数量较少，血栓边缘有部分新生血管，可见中性粒细胞和少量成熟再通血管。而rhG-CSF组血栓中胶原含量相对较少，巨噬细胞数量多，其周围常见新生幼稚血管和成熟再通血管，巨噬细胞吞噬功能活跃，溶酶体和吞噬体增多（图2）。

    3　讨论

    经典的Virchow理论认为：静脉血流滞缓、静脉壁损伤和血液高凝状态是引起静脉血栓形成的3个重要因素［6］。应用实验性静脉血栓形成的动物模型进行临床研究已有50余年历史，静脉血栓动物模型的制备主要以阻断静脉回流，造成血液淤滞诱发血栓形成为主［7］。本研究采用大鼠下腔静脉壁机械性损伤联合静脉缩窄方法建立动物实验模型，静脉壁损伤后启动凝血，静脉缩窄使血液流动缓慢，最终导致血栓组和rhG-CSF组大鼠形成静脉血栓。该动物模型建立方法比较简单易行且经济，类似于人体的DVT过程，有利于研究血栓的再通。

    血栓的机化过程有别于创伤的机化。创伤机化愈合时，新生血管最终闭塞；而血栓机化和溶解则表现为中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞进入血栓中，血栓中的新生血管主要出现在巨噬细胞集中的区域，随着时间的延长，血栓内新生血管结合并增大形成管道，血流通过管道而实现血管的长期再通。如果机体对血栓的吸收和溶解彻底，血管可完全再通，否则出现血管狭窄或闭塞，血液倒流，从而引起血栓后综合征。因此增加血栓的机化和血管新生可减轻静脉瓣膜的损害和阻塞、预防血栓后综合征的发生，对于有抗凝、溶栓治疗禁忌证的患者尤为重要。

    近年来，自体骨髓干细胞动员和移植开始广泛应用于血管新生疗法的研究［8］。骨髓干细胞动员是指骨髓释放其干细胞到外周血中，通过机体自身的代偿机制或使用动员剂等的干预，促使骨髓干细胞迁移到外周血，增加血液中干细胞数量。研究表明，外源性治疗可诱导骨髓来源的干细胞，应用骨髓动员剂将骨髓细胞“驱赶”到外周血，增加外周血干细胞数量，就增加了干细胞“归巢”到缺血损伤组织的数量，血管新生也就加快了速度、加大了幅度，并在特定的病理环境下修复受损的组织及改善功能［9］。骨髓还因作为多种血管生长因子和趋化因子的自然来源，可能成为在缺血条件下促进血管新生的有效材料。rhG-CSF几乎可动员骨髓中的各类干细胞入血，是骨髓干细胞强有力的动员剂，虽然人与大鼠有种属差别，但rhG-CSF可以安全有效的应用于大鼠的骨髓细胞动员。前期实验已证实，与血栓组比较，应用rhG-CSF 7 d以后，能有效动员骨髓单核细胞入血，外周血中单核细胞数量显著上升并增高数十倍，单核细胞所占的比例在7 d达到最高，血栓中炎性细胞数量增多，血栓机化范围广泛，血栓机化率显著增加，再通血管形成增多，促进了血栓的溶解吸收过程［9］。

    本研究应用rhG-CSF，无论术后第7天和第14天，与血栓组比较，2组间差异均有统计学意义（P<0.05）。电子显微镜结果则显示：rhG-CSF组血栓中有较多的巨噬细胞，周围常见新生幼稚血管和成熟再通血管，新生及再通血管的形成增多，巨噬细胞吞噬功能活跃，血栓机化增快，吸收增加。可见通过rhG-CSF动员骨髓干细胞增加了血栓中巨噬细胞密度，增强了血栓中巨噬细胞的功能。Takagi等［11］研究还发现rhG-CSF不仅动员骨髓细胞入血，而且还促进巨噬细胞的增殖、分化和植入，抑制其凋亡，增加基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP）的表达。这些作用有助于巨噬细胞、内皮细胞进入血栓中，促进血栓的溶解、吸收和再通。

   新近研究发现血栓中的巨噬细胞主要来源于骨髓，表达内皮标记的骨髓祖细胞在术后第7天出现在血栓的周边区域，第14天时贯穿于血栓的整个区域，但是骨髓来源的祖细胞并未排列在血栓内以及血栓与血管壁之间形成的再生管腔表面，同时用绿色荧光蛋白转基因小鼠的骨髓替代正常小鼠骨髓后发现，血栓中绿色荧光蛋白阳性的大部分细胞表达内皮细胞标记物LEGFR 2，3/4的骨髓细胞表达巨噬细胞标记物CD68。因此，该文献推测血栓中来源于骨髓的祖细胞刺激了血栓溶解的再生血管过程［5］。

   血栓中聚集的巨噬细胞通过表达一系列蛋白酶（包括MMP），可以调节基质细胞增殖、迁移以及重塑，是细胞外基质降解的主要酶类。其激活因素包括生长因子、细胞间的接触以及细胞与基质间的作用，MMP通过对内皮和间质中基质的降解作用以及生长因子的激活作用启动血管生成［11-12］，另外巨噬细胞还能分泌巨噬细胞源性生长因子，可以刺激内皮细胞及平滑肌细胞增殖。总之，巨噬细胞可以通过产生多种血管生成因子如TNF-α、b-FGF和VEGF等，选择性地作用于内皮细胞，促进其增殖、迁移，改变内皮细胞的某些表达，促使内皮细胞分泌组织因子、胶原酶等，从而改变内皮细胞的细胞外基质，增加基质蛋白水解酶、基质分子和基质受体的表达，促进血管生成。

【参考文献】[1] Joffe HV, Goldhaber SZ. Upper-extremity deep vein thrombosis[J]. Circulation, 2006,106（14）:1874-1880.

[2] 吴庆华.急性下肢深静脉血栓的溶栓抗凝治疗[J].中国实用外科杂志，2003，23（4）：202-205.

[3] Ali T, Humphrise J, Burnard K, et al. Importance of recruitment in venous thrombus resolution[J]. J Vasc Surg, 2006,43（5）:601-608.

[4] Misao Y, Takemura G, Arai M, et al. Importance of recruitment of bone marrow-derived CXCR4+ cells in post-infarct cardiac repair mediated by G-CSF[J]. Cardiovasc Res, 2006,71（3）:455-465.

[5] Modarai B, Burnand KG, Sawyer B, et al. Endothelial progenitor cells are recruited into resolving venous thrombi[J]. Circulaton. 2005, 111（20）: 2645-2653.

[6] 王玉琦，叶建荣.血管外科治疗学[M].上海：上海科学技术出版社，2003：216.

[7] 刘政，侯玉芬，周涛.深静脉血栓形成动物模型的建立及应用进展[J].中国中西医结合外科杂志，2005，11（5）:451-453.

[8] 侯向前，吴学君，张精勇，等.自体骨髓干细胞移植治疗下肢动脉缺血性疾病的疗效观察[J].中国现代普通外科进展，2007，10（4）：320-323.

[9] Kong D, Melo LG, Gnecchi M, et al. Cytokine-induced mobilization of circulating endothelial progenitor cells enhances repair of injured arteries[J]. Circulation, 2004, 110（14）:2039-2046.

[10] 陈以宽，龚建平，罗文军，等.骨髓干细胞动员在深静脉血栓溶解中的作用[J].重庆医科大学学报，2007，32（6）：626-628.

[11] Takagi Y, Yoshiyama M, Omura T, et al. Effects of granulocyte-colony stimulating factor on cardiac remodeling after myocardial infarction[J]. Osaka City Med J, 2005,51（2）:43-50.

[12] Van Hinsbergh VW, Engelse MA, Quax PH. Pericellular protease in angiogenesis and vasculogenesis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006,26(4):716-728.