骨髓CD34+干细胞种植人工血管应用于血管置换后内皮化和通畅率的研究
发表时间：2009-08-07 浏览次数：794次
作者：廉维帅 于振海 王坤 张曙光 李光新 作者单位：1山东大学医学院 （山东 济南 250012） 2山东省千佛山医院 普外中心 （山东 济南 250014）
【摘要】 目的：探讨骨髓CD34+细胞分别种植于常用膨体聚四氟乙烯（expanded polytera fluoroethylene, ePTFE）人工血管和涤纶人工血管的内皮化程度和通畅率。方法：选杂种犬16条，依人工血管不同分为ePTFE血管实验组（6条）和涤纶血管实验组（6条）及ePTFE对照组（2条）和涤纶对照组（2条），实验犬采自体骨髓，提取CD34+细胞种植覆膜人工血管，对照犬采用单纯自体血预凝人工血管，将ePTFE或涤纶人工血管植入所有杂种犬的下腔静脉和腹主动脉。术后第30、60、100天取标本，观察通畅率，并分别用光学显微镜、电子显微镜和免疫组织化学方法观察新生内膜表面内皮化情况。结果：对照组静脉全部阻塞。实验组第30天人工血管腔面新生内膜内皮细胞密度自吻合口向中间方向逐渐减少，第60天的人工血管内皮基本覆盖管壁，第100天人工血管腔面内膜内皮细胞排列均匀完整，而对照组内膜表面无内皮细胞覆盖。结论：经纯化的CD34+细胞种植于ePTFE和涤纶人工血管较未种植的人工血管中远期有较好的内皮化和通畅率。
【关键词】 人工血管·抗原，CD34·骨髓移植·内皮细胞
Intermediate and long-term patency rate and endothelialization study of displace of blood vessel with prostheses seeded by CD34+ stem cells
LIAN Wei-shuai1, YU Zhen-hai2, WANG Kun2, ZHANG Shu-guang2, LI Guang-xin2
1Medical College of Shandong University （Jinan 250012, China）
2Department of General Surgery, Shandong Provincial Qianfoshan Hospital （Jinan 250014, China）
【ABSTRACT】 Objective: To investigate the endothelialization and intermediate and long-term patency rate of prostheses seeded by CD34+ stem cells. Methods: sixteen crossbred dogs were randomized into 2 groups. Prostheses covered with ePTFE or Dacron were implanted into the abdominal aorta artery(AAA) and inferior vena cava (IVC). Twelve dogs were implanted by prostheses seeded by CD34+ stem cells, 4 dogs were implanted by autogenous blood only as control. The prostheses were explanted at thirty or sixty or one hundred days. Light and electron microscopy were applied to examine endothelialization of prostheses. CD34 factor stain was used to identify endothelial cells. Results: All venous prostheses implanted by autogenous blood were blocked. Others were patent. Confluent endothelial cells appeared on the neointima of seeded prostheses. There were no endothelial cells in the no-implanted prostheses. Conclusion: Endothelialization and higher patency rate might be achieved in the prostheses covered with ePTFE or Dacron that were implanted by CD34+ stem cells.
【KEY WORDS】 Blood vessel prosthesis·Antigens, CD34·Bone marrow transplantation
小口径人工血管置换，其近期血栓形成或远期内膜增生致人工血管闭塞，是临床上常见的并发症，尤其静脉系统因压力低、血流速度慢，人工血管的近远期通畅率更差［1］。术后远期失败者，主要系人工血管内膜增生，移植段远侧动脉粥样硬化性病变继续进展，使吻合处内膜增生所致［2］。因此，内皮化的人工血管成为血管外科工作者梦寐以求的目标。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 济南地区杂种犬16条，雌雄不限，犬龄1～2岁，体质量（15.8±1.4） kg。随机分为膨体聚四氟乙烯（expanded polytera fluoroethylene, ePTFE）组和涤纶组２组，每组实验犬6条、对照犬2条。
1.2 方法 髂后上嵴采集骨髓，采用免疫磁珠方法进行CD34+细胞的分离，人工血管预凝，ePTFE和涤纶内皮化人工血管分别植入实验犬下腔静脉和腹主动脉，而对照犬人工血管只用自体血浆预凝。术后内皮化人工血管检测，第30、60、100天分别取材ePTFE组实验犬和涤纶组实验犬各2只，每只取动脉1根、静脉1根；ePTFE组和涤纶组对照犬于第60天同时全部取材，同样每只犬取动、静脉各1根。具体步骤见相关文献[3]。
1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包进行分析，数据以x±s表示，采用t检验。P≤0.05为差异统计学意义。
2 结果
2.1 通畅率与狭窄程度 纵行剖开腔面，术后第30天取材的人工血管的新内膜均已完全覆盖腔面，其表面光滑，呈半透明状，未见血栓附着，ePTFE组和涤纶组取材的人工血管管腔无狭窄（图1）。
第60天取材ePTFE血管实验组和涤纶血管实验组，新内膜完整，表面基本光滑，有少量点状新鲜血栓形成，管腔无阻塞，吻合口组织轻度增生，有轻度狭窄，ePTFE组2根静脉人工血管管腔狭窄达30%、40%，1根动脉人工血管吻合口处狭窄达20%,另1根动脉人工血管狭窄不明显（见图1）；涤纶组2根静脉人工血管管腔狭窄分别达30%、40%，1根动脉人工血管吻合口处狭窄达20%另一根动脉人工血管狭窄不明显。
对照组全部第60天取材，可见动脉吻合口高度组织增生，重度狭窄，管腔内充满血栓，冲洗血栓后，可见管腔内膜由陈旧机化血栓组织增厚组成。4根静脉人工血管管腔闭塞，涤纶对照2根动脉人工血管管腔明显狭窄达70%、80%，ePTFE对照组2根动脉人工血管管腔明显狭窄达50%、60%（见图1）。
第100天取材见ePTFE实验组1根静脉人工血管管腔闭塞，另1根静脉人工血管管腔明显狭窄达80%，1根动脉人工血管管腔明显狭窄达60%，另1根动脉人工血管狭窄不明显。涤纶试验组2根静脉人工血管管腔明显狭窄分别达70、80%，1根动脉人工血管管腔狭窄达50%，另1根动脉人工血管狭窄不明显。总体内皮化人工血管植入动脉闭塞率为0，ePTFE组动脉狭窄率25%，涤纶组动脉狭窄率25%；人工血管植入静脉ePTFE组闭塞率12.5%、狭窄率37.5%；涤纶组闭塞率0、狭窄率37.5%；对照组植入动脉闭塞率0、狭窄率100%，对照组植入静脉闭塞率100%。
2.2 测量内膜厚度 实验组2种人工血管动脉内膜厚度之间差异有统计学意义（P<0.05）；2种静脉内膜厚度之间差异有统计学意义（P<0.05）；实验组动脉与静脉内膜厚度之间差异无统计学意义（P＞0.05，表1）；实验组和对照组新内膜厚度差异有统计学意义（P<0.05，表2）。
2.3 扫描电子显微镜观察 第30天时，ePTFE血管实验组和涤纶血管实验组可见吻合口处出现大量新生内皮细胞，沿血管轴向排列，自吻合口向人工血管中段的腔面新内膜内皮细胞密度逐渐减少，中段腔面部分区域可见片状分布的内皮细胞（图2）。
第60天时ePTFE血管实验组和涤纶血管实验组取材，总体人工血管新生内皮细胞已开始覆盖大部分腔面，且距吻合口处越近内皮细胞排列越紧密，流入道吻合口处新生内膜较流出道吻合口处的新生内膜完整，中段腔面内皮细胞分布稀疏但基本覆盖管壁。涤纶人工血管的新内膜覆已较完整内皮细胞层，这些细胞排列紧密，与血管长轴走行一致。ePTFE血管新生内膜较同期涤纶血管新生内膜欠完整，中段少量区域内皮层缺乏，表面附着纤维素和血细胞，其间见坏死和衰老的内皮细胞（见图2）。第100天时，保持通畅的血管吻合口内皮细胞致密排列，内皮细胞形态成熟，中段腔面内皮细胞分布稀疏但基本覆盖管壁。高倍镜下可见细胞伸展良好，伪足丰富，均有较强活性，细胞融合成片（见图2）。对照组人工血管内膜表面无内皮细胞覆盖，仅见血小板沉积形成的血栓及纤维组织排列（见图2）。
3 讨论
血管疾病是世界范围内最常见的疾病之一，动脉缺血性疾病临床处理多需行病变血管置换，除部分应用自体血管外，大部分应用人工血管进行动脉旁路重建［4］。随着人工血管的广泛应用，在大中动脉血管因血流速度快，人工血管的通畅率较高；而小口径人工血管(4～6 mm)，如下肢动脉旁路应用的人工血管，由于血流量小、组织顺应性不佳或非稳定性血液动力学状态等原因，造成近、远期通畅率不高［5］。对于小口径人工血管置换，其近期血栓形成或远期内膜增生致人工血管闭塞，是临床上常见的并发症，尤其静脉系统更因压力低、血流速度慢，导致人工血管的近、远期通畅率更差［6］。因此人工血管作为一种非生物材料，其近、远期通畅率是所有血管外科工作者最为关心的问题。
本研究中第60天取材的ePTFE实验组和涤纶实验组动静脉新内膜增生程度都明显小于对照组；实验组取材的静脉管腔都有不同程度的狭窄，对照组静脉人工血管管腔全部闭塞，而实验组取材的动脉管腔狭窄程度也明显小于对照组。电子显微镜下，实验组细胞排列紧密，细胞走行与血管长轴一致，只有管腔中段区域少量内皮层缺乏，表面附着纤维素和血细胞，而对照组人工血管内膜表面无内皮细胞覆盖，仅见血小板沉积形成的血栓及纤维组织排列。第100天取材见实验组静脉管腔均明显狭窄，闭塞率明显优于对照组，实验组动脉管腔狭窄率也明显优于对照组。由此可见骨髓CD34+干细胞种植人工血管应用于血管置换后可明显抑制内膜增生从而改善人工血管的通畅率和内皮化的程度。
总体来看，动脉系统人工血管内皮化程度和通畅率优于静脉系统。人工血管出现闭塞或狭窄主要与血流动力学的改变和人造血管内皮层的形态和功能上的不完整性有关。
总之，本研究从骨髓中分离CD34+细胞培养种植于人工血管比对照组取得了良好的内皮化和通畅率，为提高临床中小口径人工血管移植后通畅率，减少术后血栓形成和内膜增生等并发症，为探索具有抗栓和抑制新生内膜增生的半生物化人工血管提供了新的思路。
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