三氧化二砷对人结肠腺癌裸鼠肝转移癌胚抗原水平的影响

     作者：孙华君    作者单位：青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院　腹部外科　（山东　烟台　264000）

     【摘要】  目的：探索应用三氧化二砷（As2O3）治疗人结肠腺癌肝转移后对荷瘤裸鼠血清、腹水及癌组织中癌胚抗原（carcinoembryonic,CEA）水平的影响。方法：在建立人结肠腺癌裸鼠肝转移模型后15 min（早期治疗组）、10 d（中期治疗组）、20 d（晚期治疗组）经尾静脉注射As2O3（5 mg/kg·d）；并以模型建立后10 d经尾静脉注射生理盐水作为对照组。于接种癌细胞4周后，采集血、腹水和癌结节，分别检测其CEA含量。结果：早期治疗组的血、腹水和癌结节中的CEA含量均明显低于对照组（P＜0.01）；晚期治疗组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：早期应用As2O3能有效降低荷瘤裸鼠的血清、腹水和癌结节中CEA水平。

     【关键词】  结肠肿瘤 腺癌 三氧化二砷 癌胚抗原 肝脏肿瘤 肿瘤转移

     Alternation of CEA levels in nude mice with liver metastases from human colon adenocarcinoma treated with arsenic trioxide

    SUN Hua-jun, JIANG Li-xin, DONG Guo-sheng, GUO Ji-tian, Lü Zhong-chuan,ZHENG Hai-tao, CHEN Hong-bing

    Department of Abdomen Surgery，the Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University Medical College （Yantai 264000，China）

    【ABSTRACT】 Objective：To investigate the change of CEA levels of blood, ascites and cancer tissue with liver metastases from human colon adenocarcinoma treated with arsenic trioxide（As2O3）. Methods： As2O3（5 mg/kg·d） was injected through tail vein at 15 min （early treatment group）, 10 d （middle treatment group） and 20 d （late treatment group） after the model of liver metastases from human colon adenocarcinoma in nude mice were established respectively. Physiological saline was injected through tail vein at 10 d after the model of liver metastases was established as a control group. Results：The CEA levels of blood, ascites and cancer tissue in early treatment group were significantly decreased compared with the control group （P＜0.01）; but, there was no difference between the late treatment group and the control group（P＞0.05）. Conclusions：The CEA levels of blood, ascites and cancer tissue in nude mice with liver metastases from human colon adenocarcinoma could be lowered significantly when As2O3 is used early after the model of liver metastases was established.

    【KEY WORDS】 Colon neoplasms·Adenocarcinoma·As2O3· Carcinoembryonic·Liver neoplasms·Neoplasm metastasis

    结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是当前最常见的消化道恶性肿瘤之一。肝脏转移是影响结直肠癌根治效果的主要因素之一。由于肝脏转移癌往往是多发的，有时甚至是弥漫性的，虽有手术切除、介入治疗、化学疗法等多种方法，但一直都未能取得较满意的效果。三氧化二砷（arsenic trioxide， As2O3）系中药砒霜的主要成分，近年来，许多临床研究均证实As2O3能有效治疗急性早幼粒细胞性白血病（acute promyelocytic leukemia， APL），其完全缓解（complete remission, CR）率可达87%［１］。本研究在建立人结肠腺癌裸鼠肝转移模型的基础上，于不同时相点应用As2O3治疗荷瘤裸鼠，观察荷瘤裸鼠的血液、腹水及癌组织中癌胚抗原（carcinoembryonic, CEA）的变化。为临床应用As2O3治疗CRC并肝转移提供实验基础。

    1　材料与方法

    1.1　细胞培养　表达CEA阳性的人结肠腺癌LS-174T细胞株由中国科学院上海细胞生物研究所从美国标准菌库引进并提供，该细胞在接种裸鼠脾脏后可发生肝转移［２］。LS-174T细胞常规在RPMI 1640培养液（内含10%灭活小牛血清、100 U/mL青霉素、50 mg/mL链霉素）中培养；置于CO2孵箱中，恒温37 ℃，5%CO2，饱和湿度。细胞培养密度（0.1~1.0）×106，倍增时间20~24 h。每3~4天传代1次。取对数生长期细胞用0.25%胰酶（D-Hanks液配置）消化，制备成单细胞悬液，锥虫蓝染色测定细胞活力≥95%，调节细胞浓度为1×107 mL-1备用。

    1.2　实验动物　BALB/C-nu/nu裸鼠32只（第三军医大学实验动物中心提供），4~6周龄，雌雄兼用，体质量14~23 g，在无致病菌（specific pathogen free,SPF）条件下饲养。亚砷酸注射液（每支10 mL，内含As2O3 10 mg）由哈尔滨医科大学第一临床医院提供（批号：国药准字X19990191）。

    1.3　结肠腺癌裸鼠肝转移模型的建立　参照左国华等［３］方法进行。在超净工作台内按照无菌手术原则操作。1%戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔内麻醉，皮肤用75%乙醇消毒，左上腹纵行切口（长度约1.0 cm），进腹后先小心结扎离断脾胃韧带，显露游离脾脏并拉至切口外。用4#针穿刺脾组织（不要刺穿脾脏），缓慢（1~2 min）注入LS-174T细胞悬液0.2 mL（含细胞2×106个），可见注射部位脾脏被膜变白、肿胀，拔出针头后即用95%乙醇棉球压迫，以杀死可能溢出的癌细胞。轻揉5 min后，切除脾脏，关腹。术后裸鼠继续在SPF条件下饲养。

    1.4　实验分组　32只裸鼠随机分成A、B、C、D 组，每组8只。4组分别为早期治疗组、中期治疗组、晚期治疗组和生理盐水对照组。A、B、C 组分别于接种癌细胞15 min、10 d和20 d由荷瘤裸鼠尾静脉注射As2O3 5 mg/kg 0.2 mL。D组于接种癌细胞10 d后由荷瘤裸鼠尾静脉注射生理盐水0.2 mL。给药均在超净工作台内进行，1次/d，在接种癌细胞后第4周时剖腹，分别采集荷瘤裸鼠血、腹水和肝脏转移癌组织，检测其CEA含量。

    1.5　检测指标及方法

    1.5.1　荷瘤裸鼠血清和腹水中CEA含量测定　裸鼠用摘眼球法取血，离心分离血清；剖腹时留取腹水。血清及腹水均采用双抗体放射免疫分析法测定CEA含量。

    1.5.2　荷瘤裸鼠癌组织中CEA含量测定　切取癌组织称重200 mg，在冰上切碎，置于4 ℃ 0.001 mol/L Tris缓冲液（pH=7.2）中。反复超声粉碎匀浆6次，30 s/次，再加入3倍瘤组织体积的0.002 mol/L pH=7.0的PBS溶液，混匀，镜下观察细胞已破裂后，4 ℃离心（4 000 r/min，60 min），留取上清，癌组织CEA即在上清中。采用双抗体放射免疫分析法测定其中CEA含量。

    1.6　统计学处理　采用SPSS 12.0统计学软件，行t 检验，数据以x±s表示。P≤0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　荷瘤裸鼠血清CEA含量的变化　早、中期治疗组荷瘤裸鼠血清中CEA含量均明显低于对照组（P＜ 0.01）；晚期治疗组与对照组血清中CEA含量差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

    2.2　荷瘤裸鼠腹水CEA含量的变化　早期治疗组荷瘤裸鼠腹水中CEA含量明显低于对照组（P＜ 0.01）；中期治疗组荷瘤裸鼠腹水中CEA含量低于对照组（P＜ 0.05）；晚期治疗组与对照组腹水中CEA含量差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

    2.3  荷瘤裸鼠肝转移癌组织CEA含量的变化  早期治疗组荷瘤裸鼠肝转移癌组织中CEA含量明显低于对照组（P＜ 0.01）；而中、晚期治疗组荷瘤裸鼠肝转移癌组织中CEA含量与对照组相比差异也有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

    3　讨论

    CRC是临床常见的恶性肿瘤。肝脏是CRC首发的血道转移和术后复发部位［4］。约25%的CRC患者在确诊时就已经伴有同时性肝转移［５］；50%的CRC患者在根治术后发生异时性肝转移［６］。转移性肝癌患者大多治疗困难，预后较差，如未经治疗，平均生存仅5个月［７］。因此，努力提高CRC肝转移的治疗效果，是一个十分重要的研究课题。

    As2O3系中药砒霜的主要成分，其药用历史悠久。张鹏等［８］应用As2O3注射液，每日10 mL（内含As2O3 10 mg）静脉滴入治疗APL患者72例，初发患者30例，CR 73.3%，有效率90%；复发及难治患者42例，CR 53.3%，有效率64.2%。钱军等［9］报道应用As2O3注射液治疗原发性肝胆癌33例，CR 1例，部分缓解（partial remission, PR） 4例，无变化（no change, NC）24例，进展（pregess differentiation, PD）4例，缓解率（CR+PR）为15.2%。其中29例原发性肝癌中，PR 4例，NC 21例，PD 4例，缓解率为13.8%，缓解时间3~28个月（中位缓解时间5个月）。4例胆囊癌中，CR 1例（缓解时间8个月），NC 2例，PD 1例。而且对部分肝区疼痛的患者有显著的镇痛作用。因此，本研究认为As2O3治疗原发性肝胆癌疗效确切、安全，不良反应少，有一定的临床应用前景。

    本研究以人结肠癌裸鼠肝转移模型为研究对象，探索As2O3的体内抗肿瘤作用。根据文献［１０］小鼠的药物用量是临床人的用量的25~50倍（按单位质量计算）。本研究采用As2O3注射液临床治疗APL用量0.15 mg/kg·d的33倍即5 mg/kg·d作为使用剂量［１１］，观察其不同时相点对人结肠腺癌裸鼠肝转移血清、腹水和癌组织中CEA表达的影响。

    CEA是一种在胚胎和某些肿瘤组织，尤其是在大部分原发和转移性结直肠癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤组织中特异表达的糖蛋白［12］，属于免疫球蛋白超家族，作为一种黏附分子可能在细胞分化和肿瘤发生及转移过程中起重要作用。临床上常用于结直肠癌术后疗效的观察及转移的监测，结肠癌表达CEA比正常细胞高10~100倍，并且大量分泌到血液中，有利于癌细胞的转移。Jessup 等［13］证实给予外源性CEA可增加结直肠癌细胞在肝内的停留，促进其发生肝转移。本研究显示，As2O3能够不同程度地降低荷瘤裸鼠的血清、腹水及癌组织中CEA的表达；早期治疗组荷瘤裸鼠的血清、腹水及癌组织中CEA含量均显著低于对照组（P＜ 0.01）。说明As2O3能作用于表达CEA的结肠腺癌细胞，从而减少CEA的分泌。而晚期治疗组的荷瘤裸鼠，可能由于癌结节较大，癌细胞数目众多，故其CEA水平也较高。

    本研究表明，As2O3注射液对结直肠癌裸鼠肝转移有一定的治疗作用，能够不同程度地降低荷瘤裸鼠的血清、腹水及癌组织中CEA的表达。早期应用As2O3可能取得较好的疗效，过晚，其疗效则不显著。本研究药物剂量仅适用于裸鼠，临床使用剂量还需进一步研究。

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