七叶皂苷对大鼠重症急性胰腺炎NF-κB表达的影响

作者：殷响，吴德全，王强    作者单位：1.大庆油田总医院 普外科，黑龙江 大庆 163000；2.哈尔滨医科大学附属二院 普外科，黑龙江 哈尔滨 150086；

【摘要】  目的 观察重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)大鼠胰腺核因子-κB(NF-κB)的活性、血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平及七叶皂苷对其的影响，探讨七叶皂苷治疗SAP 的作用机制。方法 96只雄性Wistar大鼠，质量250～300 g，随机分为3组（假手术组、SAP组、七叶皂苷治疗组），每组32只。各组分别在术后第3，6和12小时各处死8只大鼠检测胰腺组织NF-κB活性、血清TNF-α水平及胰腺病理评分，各组剩余8只大鼠观察术后24 h死亡率。结果 SAP组与假手术组比较，胰腺组织NF-κB活性增强(P<0.05)，血清TNF-α水平明显升高(P<0.05)，七叶皂苷治疗组胰腺组织NF-κB活性、血清TNF-α水平、胰腺病理损害、24 h大鼠死亡率明显低于SAP组(P均<0.05)。结论 七叶皂苷可以在体内抑制NF-κB在胰腺组织中的活化，减少细胞因子TNF-α过度释放，可能是其治疗SAP的作用机制之一。

【关键词】  胰腺炎；七叶皂苷；核因子-κB；肿瘤坏死因子-α；大鼠

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是临床常见的危重病之一，其发病急，进展快，病死率可高达20%~40%[1]。寻找有效的治疗药物，提高SAP的存活率，一直是临床研究的热点。七叶皂苷(aescine)是从七叶树科植物天师粟的干燥成熟果实（娑罗子）中提取的一种含酯键的三萜皂苷的天然植物药，具有抗炎、抗渗出等广泛的药理作用[2]。本实验通过动态观察七叶皂苷对大鼠重症急性胰腺炎胰腺组织核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活性和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）蛋白表达等指标的影响，探讨七叶皂苷治疗SAP的作用机制。

    1  材料和方法

    1.1  实验材料  选取成年健康雄性Wistar大鼠96只（哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供)，质量250～300 g。实验试剂中七叶皂苷钠购自山东绿叶制药有限公司；牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司；TNF-α放射免疫分析试剂盒购自北京北方生物技术研究所；Nuclear factor-κB p65单克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色试剂盒、多聚赖氨酸购自美国Santa Cruz公司。

    1.2  实验方法  胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠(1 ml/kg)制作大鼠SAP模型，参照Aho等[3]的方法并略加改进。将96只Wistar大鼠随机分为3组（假手术对照组、SAP模型组和七叶皂苷治疗组），每组32只。SAP组和治疗组大鼠先制成SAP模型，治疗组在成模后5 min自阴茎背静脉注射七叶皂苷钠2 mg/kg，用生理盐水稀释为1 ml。SAP组在成模后5 min自阴茎背静脉注射生理盐水1 ml。假手术组手术过程同SAP和治疗组，但5%牛磺胆酸钠改为等量生理盐水，术后5 min自阴茎背静脉注射生理盐水1 ml。3组大鼠术毕后都经背部皮下注射生理盐水20 ml/kg补液。术后各组于第3，6，12小时分别处死8只大鼠。各组其余8只大鼠观察24 h死亡率。

    于各时间点开腹经下腔静脉穿刺取血2 ml，离心取血清置于-20℃冰箱中待检。取相同部位胰腺组织，约1 cm×1 cm×0.3 cm，4%多聚甲醛溶液内固定48 h，常规脱水，透明，石蜡包埋，连续切片，行HE和免疫组化染色。

    1.3  指标检测

    1.3.1  免疫组化法检测NF-κB p65表达  采用链霉素抗生物素过氧化物酶连结法（streptavidin perxidase conjugated method，SP）进行免疫组化染色检测NF-κB p65表达。光镜下观察，以胞核染成棕黄色的细胞为阳性细胞。不重复随机选取5个高倍视野（×400），每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞占总细胞的百分率，为阳性率。

    1.3.2  血清TNF-α蛋白含量测定　　用放射免疫法(RIA)测定TNF-α蛋白含量。按试剂盒说明书操作，试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

    1.3.3  胰腺组织病理学评分 　各组石蜡标本切片，HE染色，请两名经验丰富的病理科医师按双盲法分别阅片，每片随机选取5个高倍视野(400倍)，以Gross等[4]的评分标准对5个单项(水肿、炎性细胞浸润、脂肪坏死、实质坏死、出血灶)进行评分，每个单项10个得分（每个病理医师5个得分，两名医师共10个得分）的平均分为该单项得分，5个单项得分之和为该标本的病理学评分。得分越高，胰腺组织的病理改变越重。

    1.3.4  测定24 h死亡率  每组随机抽取8只大鼠观察24 h死亡率。

    1.4   统计学方法  实验数据采用x±s表示，应用SPSS10.5软件，两组均数间比较采用t检验，率的比较采用?字2检验。

    2  结果

    2.1  胰腺组织中NF-kB p65活性  假手术组各时间点NF-kB p65蛋白阳性表达率极低。SAP组在第3小时表达明显增强，第6小时达到高峰，第12小时表达有所减弱。治疗组在各时间点阳性表达率均低于SAP组。各时间点，SAP组与假手术组比较差异有统计学意义（P均<0.05）；治疗组与SAP组比较差异亦有统计学意义（P均<0.05）（见表1）。

    2.2  血清TNF-α蛋白水平  SAP组第3，6，12小时的TNF-α水平呈逐渐升高趋势，均明显高于假手术组；治疗组各时间点TNF-α水平低于SAP组但仍高于假手术组。各时间点SAP组与假手术组比较差异有统计学意义（P均<0.05）；治疗组与SAP组比较差异亦有统计学意义（P均<0.05）（见表2）。

    2.3  胰腺组织形态学变化  光镜观察：假手术组胰腺组织腺泡结构基本正常；SAP组可见胰腺组织水肿、出血、坏死，大量炎细胞浸润并随时间延长而加重；治疗组胰腺组织改变较SAP组均有所减轻（见表3）。

    2.4  24 h死亡率  每组随机抽取8只大鼠观察24 h死亡率，假手术组为0％(0/8)，治疗组为12.5%(1/8)，两组明显低于SAP组62.5%(5/8)。治疗组与SAP组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

    3  讨论

     SAP的发病机制尚未完全阐明。目前认为，胰酶高分泌和自身消化、微循环障碍、氧自由基损伤、炎症介质及多种细胞因子级联反应均与SAP有关。其中白细胞过度激活，炎症介质和细胞因子级联反应在SAP从局部病变发展为全身炎症反应综合征和MODS过程中发挥着重要作用，NF-κB作为多种炎症介质及细胞因子的上游调节因子，其活化是此过程的关键环节[5]。目前，大量的实验及临床均发现TNF-α、IL-1β是启动急性坏死性胰腺炎时免疫网络紊乱的主要细胞因子[6-8]，它们的基因启动子中都含有NF-κB的结合位点，其表达在基因水平上受到NF-κB的调控。Dunn等[9]在大鼠急性胰腺炎中发现NF-κB活性在诱导后4 h明显升高，并持续24 h，其调控的TNF-αmRNA也随之升高，用异戊巴比妥阻断NF-κB活性后，TNF-αmRNA表达降低，胰腺炎的严重程度亦减轻。

    实验中我们发现，SAP诱发后，SAP组胰腺腺泡中的NF-κB在术后3 h有明显激活，6 h活性达到最高，12 h活性仍高于正常，各时间点NF-κB活性明显高于假手术对照组，胰腺病理损害逐渐加重也提示了SAP早期NF-κB就有活化，且参与了SAP 的炎症反应。另外，SAP模型组胰腺腺泡细胞胞核中NF-κB活性在术后3 h、6 h及12 h均较假手术对照组显著升高，同时血液中炎症细胞因子TNF-α在术后3 h、6 h及12 h亦较对照组显著升高，这可能是因为NF-κB从胞浆进入胞核后，与特定的DNA片段结合，导致炎症介质基因水平的转录、翻译、表达开始，炎症介质进入血液循环后又激活机体其他炎症细胞产生、释放大量炎症介质。

    七叶皂苷钠是从中药娑罗子的干燥成熟果实中提取的三萜皂苷的钠盐[10]，研究发现它对多种组织损伤有抗炎、抗渗出及消肿作用，并能恢复毛细血管的正常通透性。结合七叶皂苷药理作用其抑制NF-κB可能通过有以下两条途径：?譹?訛七叶皂苷钠能刺激内源性肾上腺皮质激素产生，而糖皮质激索可以抑制NF-κB的活化[9，11]；?譺?訛急性胰腺炎早期腺泡细胞氧自由基大量生成并造成细胞损伤与NF-κB的激活密切相关[12]，七叶皂苷钠的结构中含有酚羟基，能有效地清除自由基。七叶皂苷钠对SAP时NF-κB的激活是否有抑制作用尚未见报道。本研究发现用七叶皂苷钠治疗大鼠SAP后胰腺组织的NF-κB活性显著下降，同时血清TNF-α水平也降低，胰腺病理损害得到改善，动物死亡率降低。以上表明七叶皂苷钠能够通过抑制SAP时胰腺组织的NF-κB活性，减少细胞因子TNF-α过度释放，对SAP的病理改变及预后产生有利影响。七叶皂苷钠药理作用广泛，是否还有其他途径减轻SAP病理损害，有待进一步研究。

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