乌司他丁对大鼠胰腺缺血再灌注损伤的保护作用

作者：梁道明，张毅，陈元岩，袁勇，周东，陈嘉勇    作者单位：昆明医学院第二附属医院 急诊外科，云南 昆明 650101

 【摘要】  目的 探讨乌司他丁对大鼠胰腺缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。方法 SD大鼠72只随机分为假手术组（C）、缺血再灌注组（I）和乌司他丁组（U）。采用ELISA和免疫组化方法检测大鼠血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、胰腺组织bcl-2蛋白和热休克蛋白70（HSP70）表达的变化；并观察胰腺病理组织学改变。结果 缺血再灌注组的各时点TNF-α含量明显高于假手术组和乌司他丁组（P<0.05）；缺血再灌注组和乌司他丁组的IL-1β含量在6，12，24 h较假手术组明显增加（P<0.05），但乌司他丁组增高水平明显低于缺血再灌注组（P<0.05）；乌司他丁组在再灌注6，12，24 h时bcl-2蛋白表达明显高于缺血再灌注组和假手术组（P<0.05），后两组各时点表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；缺血再灌注组和乌司他丁组HSP70的表达在12，24 h较假手术组明显增加（P<0.05）。病理组织学观察：乌司他丁组炎症反应较缺血再灌注组明显减轻。结论 乌司他丁能降低大鼠胰腺缺血再灌注损伤时血清TNF-α、IL-1β水平和上调胰腺组织bcl-2蛋白的表达，对大鼠胰腺缺血再灌注损伤有明显保护作用。

【关键词】  乌司他丁；缺血再灌注；胰腺；细胞凋亡；大鼠

近年来研究表明肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β是参与胰腺缺血再灌注损伤的重要细胞因子[1]；细胞凋亡[2]和热休克蛋白[3]与组织器官缺血再灌注损伤有关。本实验研究乌司他丁对大鼠胰腺缺血再灌注中有无保护作用及其可能机制，为临床防治胰腺缺血再灌注损伤提供实验依据。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物及分组  SD大鼠72只（由昆明医学院实验动物中心提供），质量（250±20）g，雌雄不拘，随机分为3组：假手术组（C）、缺血再灌注组（I）和乌司他丁组（U），每组24只，各组动物又根据再灌注时间不同分为0，6，12，24 h四个时点，各时点大鼠6只。

    1.2  实验试剂  大鼠TNF-a、IL-1β免疫试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司），大鼠bcl-2、HSP70免疫组化试剂盒（北京中杉生物工程有限公司），乌司他丁（广东天普制药公司）。

    1.3  模型制备[4]  术前实验动物禁食12 h，自由进水，用4 g/L氯胺酮（50 mg/kg）腹腔注射，麻醉成功后假手术组、缺血再灌注组尾静脉推注生理盐水   1 ml，乌司他丁组尾静脉推注乌司他丁1.25万单位（5万单位/kg）。腹正中切口，分离胃脾韧带，结扎脾门血管，夹持脾脏，将胃翻向大鼠右侧，暴露膈肌与左肾动脉之间的腹主动脉，游离腹腔干至脾动脉，注药半小时后，用无创动脉夹夹闭脾动脉，造成胰腺体尾缺血模型，30 min后松开动脉夹进行再灌注，松开动脉夹前各组按上述方法再次给药1次。假手术组以相同的手术方法切开显露腹腔干及脾动脉，但不夹闭血管。

    1.4  观察指标  各组动物分别在再灌注0，6，12，24 h通过活体心脏取血约3 ml，2 000 r/min离心10 min，提取血清标本，-20℃冻存，采用ELISA方法测定TNF-α、IL-1β，具体步骤按试剂盒要求进行。切取胰腺体尾部组织约0.5 cm×0.5 cm大小，固定于福尔马林、95%酒精、冰醋酸8∶1∶1固定液中，用于HE染色和免疫组化分析。免疫组化采用SP染色法， 具体步骤按试剂盒要求进行；阳性片由北京中杉生物工程有限公司提供，用生理盐水代替一抗作阴性对照。bcl-2蛋白阳性染色细胞胞浆为棕黄色，HSP70阳性染色细胞胞浆和胞核为棕黄色[5]。400倍光镜下观察，每片随机取5个视野，每个视野计100个细胞，计算阳性与阴性细胞数，最后计算阳性百分率。阳性细胞数为0，记作（-），阳性细胞数<25%为（+），25%～50%为（++），51%～75%为(+++)，>75%以上为(++++)，并将反应强度评分，(-)评0分，(+)为l分，(++)为2分，(+++)为3分，(++++)为4分。

    1.5  统计学方法  用SPSS10.0软件统计包对实验结果进行方差分析、q检验和秩和检验，实验数据用 x±s表示，检验标准α=0.05。

    2  结果

    2．1  血清TNF-α、IL-1β的水平的变化  缺血再灌注组血清TNF-α的含量6 h达高峰，以后逐渐下降，缺血再灌注组和乌司他丁组各时点血清TNF-α的水平明显高于假手术组（P<0.05），但乌司他丁组各时点血清TNF-α的水平明显低于缺血再灌注组（P<0.05）；缺血再灌注组血清IL-1β的含量12 h达高峰，缺血再灌注组和乌司他丁组的IL-1β含量在6，12，24 h较假手术组明显增加（P<0.05），但乌司他丁组增高水平明显低于缺血再灌注组（P<0.05），见表1。

    2．2  胰腺组织bcl-2和HSP70蛋白表达水平  乌司他丁组在再灌注6，12，24 h时bcl-2蛋白表达明显高于缺血再灌注组和假手术组（P<0.05），后两组各时点表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；缺血再灌注组和乌司他丁组HSP70的表达在12，24 h较假手术组明显增加（P<0.05），但前两组比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

    2．3  组织形态学改变  光镜下假手术组和乌司他丁组各时点胰腺组织学无明显变化。缺血再灌注组胰腺组织学变化在再灌注0 h可见叶间隙增宽，毛细血管扩张充血，淤血及空泡变性，疏松结缔组织水肿明显，腺实质肿胀；再灌注6 h组织有灶状坏死，核溶解；再灌注12 h和24 h可见组织大片坏死。

    3  讨论

     缺血再灌注损伤是造成胰腺移植后各种并发症的主要原因之一，如移植术后早期胰腺炎、移植胰腺原发无功能、移植术后胰岛细胞功能不良，这些都大大降低了胰腺移植的效果。缺血再灌注损伤的具体发病机制复杂，传统观点认为与能量代谢障碍、氧自由基的产生、细胞内钙超载以及中性粒细胞激活并释放炎性细胞因子等有关。近年来研究表明细胞凋亡和热休克蛋白与组织器官缺血再灌注损伤有关。如何抑制过度炎症反应、抑制细胞凋亡、诱导细胞产生热休克蛋白作为一种内源性抗损伤机制，已成为预防胰腺缺血再灌注损伤的关键，是近年来研究胰腺缺血再灌注损伤的热点[6]。

    炎性细胞因子主要由机体的免疫细胞分泌，正常情况下，细胞因子含量极低，但在各种因素刺激如感染、外伤、缺血后其表达可急剧增加，过度表达可导致或加重组织损伤[7]。其中，TNF-α和IL-1β已被普遍认为是介导胰腺缺血再灌注损伤的主要细胞因子，其水平异常增高时，它们可直接作用于细胞，使组织细胞溶解；作用于中性粒细胞时，刺激中性粒脱颗粒，生成自由基，释放各种蛋白酶和其他水解酶，诱导细胞凋亡，造成局部组织损伤和毛细血管通透性增高，进一步加重微循环障碍，微循环障碍反过来又诱发了炎症介质的释放[8-9]。另外TNF-α、IL-1β是重要的炎性趋化因子，能够诱导单核细胞和中性粒细胞趋化浸润到炎症部位，进一步促进TNF-α、IL-1β的表达及释放，形成恶性循环，进一步加重胰腺损伤。本组实验结果显示，缺血再灌注组和乌司他丁组TNF-α、IL-1β同假手术组相比有明显升高（P<0.05），提示胰腺缺血再灌注后，炎性细胞因子起着非常重要的作用。

    细胞凋亡是维持机体自身稳定的一种重要机制，机体通过细胞凋亡消除衰老、损伤、突变的细胞，以维持机体平衡。与细胞凋亡有关的基因中，bcl-2基因是哺乳细胞中第一个被发现与线虫elegans的ced-9具有同源性，能抑制细胞凋亡的原癌基因，表达产物bcl-2蛋白是一种跨膜蛋白，在抗凋亡中发挥重要作用，可阻断因氧自由基、辐射、缺血低氧、抗肿瘤药物等刺激引起的细胞凋亡。热休克蛋白是生物在进化过程中保存下来的一组细胞内蛋白质，正常细胞有少量存在，当受到高温、病原体或缺血低氧等有关因素的刺激后，则合成增加，使变性蛋白质得以修复或降解，防止有害物质在细胞内积聚而致细胞损伤，并可增加细胞对再次刺激的耐受力[10]。

     乌司他丁是一种从健康成人尿液中提取的广谱蛋白水解酶抑制剂，含143个氨基酸，分子量67 KD，是一种典型的Kuniz型蛋白酶抑制剂。它具有两个活型功能区，能够同时抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性；同时还有明显的稳定溶酶体膜、抑制炎性介质的过度释放及改善微循环和组织灌注的作用[11]。正是因为乌司他丁具有上述三个重要的药理作用，而这三点恰恰与治疗缺血再灌注损伤的一些主要原则不谋而合，抑制这些炎性细胞因子和蛋白酶活性的增加，就有可能减轻缺血再灌注损伤。从本组实验的结果来看，缺血再灌注损伤时乌司他丁组TNF-α、IL-1β增加的程度明显低于缺血再灌注组（P<0.05），同时组织病理学结果显示：乌司他丁组病理学改变较缺血再灌注组明显减轻，说明乌司他丁在减轻胰腺缺血再灌注损伤方面有明显的保护作用；缺血再灌注组和乌司他丁组12，24 h时HSP70明显高于假手术组，提示HSP70参与了胰腺缺血再灌注损伤，但缺血再灌注组和乌司他丁组之间无显著差异，表明乌司他丁对HSP70表达无明显影响；乌司他丁组再灌注6，12，24 h时bcl-2蛋白表达明显增加，与缺血再灌注组比较差异有统计学意义（P<0.05），表明乌司他丁可以上调缺血再灌注损伤时胰腺细胞bcl-2蛋白的表达，抑制细胞凋亡；乌司他丁对大鼠胰腺缺血再灌注损伤保护作用机制可能与其上调胰腺细胞bcl-2蛋白的表达有关，但其促使bcl-2蛋白表达增强的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

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