血管组织工程研究进展

血管组织工程研究进展

(林本瑞,司忠义) 

【关键词】血管 组织工程

      组织工程的概念是美国科学基金会于1987年提出的，是综合应用生命科学和工程学的原理，研制并开发出组织、器官的替代物以解决组织缺损和器官损伤的修复和重建问题。血管组织工程是指利用血管壁的正常细胞和生物可降解材料来制备、重建和再生血管替代材料的科学。目前国内外已经进行了较多的研究以期研制出无免疫原性、抗血栓形成、组织和细胞相容性高、具有一定强度和生长性并能广泛应用于临床的血管替代物，以解决临床上治疗血管狭窄或闭塞导致的缺血性疾病自体血管移植中血管来源有限的问题［1］。

    血管组织工程的研究内容主要包括三个方面：①种子细胞的研究；②细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）替代物的研究；③组织工程血管（tissue engineered tissue）三维培养的研究。

    1  种子细胞的研究

    血管组织工程所应用的种子细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。内皮细胞覆盖于血管的内表面，呈单层排列，并能分泌多种血管活性因子如内皮素、前列腺素、NO等，具有抑制血小板聚集、抗血栓形成及抗内膜增生的作用［2］，从而保持血管的稳定性。内皮细胞在人［3］和动物［4］的血管移植物模型中已显示出提高血管通畅率的能力。因此，内皮细胞是血管组织工程中最重要的种子细胞。

    1.1  血管壁细胞  自体血管壁细胞具有无免疫原性，在体外进行培养、扩增后广泛应用于组织工程血管的研究。其来源主要有以下几个：①自体非必须的血管（如大隐静脉）；②腹膜或皮下脂肪组织（如微血管内皮细胞）。自体血管壁细胞的获取是一种机体侵入性操作，尤其是动脉的获取对机体危害更大，自体静脉位置表浅，取材相对方便。Schnell等［5］做了在心血管组织工程中大隐静脉与主动脉组织作为种子细胞的比较研究，结果显示大隐静脉平滑肌细胞具有良好的活性及增殖能力，经培养种植于生物可吸收支架后，其胶原的形成和机械特性均优于主动脉。但是从体内血管壁中获取的内皮细胞量不多，在体外培养过程中生长缓慢，且传代5~8代后迅速发生衰老。Pasic［6］用网膜脂肪来源的微血管内皮细胞进行动物试验，证实可明显提高血管通畅率，减低内膜增生，这种方法短期内可获得足量的细胞数，但不易纯化且抗血流应力差。采用自体内皮细胞作为种子细胞还存在经过传代扩增、鉴定等程序后种植于组织工程血管上需要较长的时间等问题，如何便捷有效的获取种子细胞，是影响血管组织工程临床应用的一个重要问题。

    1.2  干细胞  干细胞是一种未分化的、能够自我复制的原始细胞，具有高度分化增殖能力，可以在一定条件下，分化成各种组织细胞如内皮细胞等。因此，干细胞有可能是血管组织工程最理想的种子细胞。按其来源，分为胚胎干细胞和外周干细胞。胚胎干细胞培养技术复杂、涉及一系列伦理道德问题，临床应用困难，因而外周干细胞作为组织工程血管种子细胞的研究成为研究热点。

    1.2.1  内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPC）  内皮祖细胞又称血管母细胞，是来源于骨髓，并能在体内循环、增殖并分化为成熟EC的前体细胞。Asahara［7］等在体外将CD34+细胞诱导分化成血管内皮细胞，并证明在体内具有形成新生血管的能力。He［8］等成功用EPC作为种子细胞在动物实验中构建血管。Matsumura［9］等将EPC接种到生物可降解支架上，并移植入犬的下腔静脉，结果EPC在犬体内分化成内皮细胞和平滑肌细胞。脐血、骨髓、外周血均能分离出EPC。但是EPC的鉴定方法目前尚缺乏统一标准，可用CD34、VEGF2、CD133作为特异性标记筛选EPC［10］，且来源较少，在一些特定的病理条件下，其表型会发生改变，生物学活性下降。

    1.2.2  骨髓基质干细胞（mesenchymal stem cells,BMSCs）  骨髓基质干细胞（BMSCs）是骨髓中中胚层来源的未分化细胞，具备分化为成骨细胞、肌细胞、血管内皮细胞等多种组织细胞及高增殖的潜能。进行组织工程研究有以下优势：①取材方便；②对供体健康无害；③体外扩增能力强、不易丢失细胞表型、来源广泛、分离培养容易、不存在免疫排斥［11~13］；④不存在组织配型的问题。因此骨髓基质干细胞易于临床应用，有望成为组织工程中最理想的种子细胞。

    1.2.3  胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES） 胚胎干细胞是来源于囊胚的内细胞团，具有自我更新和无限增殖的能力。有经诱导后分化形成一个成熟个体中所有类型细胞的潜能［14］。在体外能在合适的培养条件下分化为EC及SMC［15、16］。Lenvenberg等在2002年将人的胚胎干细胞成功地诱导出内皮细胞，内皮细胞在基质胶中可以形成管样结构，种植到小鼠体内可形成有正常结构和功能的毛细血管［17］，为组织工程解决内皮化问题提供了新思路。但是目前还不能有效地诱导干细胞向特定的细胞类型分化，且具有免疫原性；还涉及到伦理道德方面、观念、社会、法律的制约，限制了其应用。

    2  支架材料的研究

　在组织工程血管构建中血管组织支架是活细胞在体外生长所需的支持物，是种子细胞生长增殖的三维空间，便于细胞粘着、生长、进行新陈代谢。因此，在组织工程血管制备中需要具有良好的生物相容性，可塑性强，来源广泛，有一定的抗张强度和无免疫原性的支架材料。根据来源和性能，目前研究应用的材料分为天然生物生材料和合成材料两种。

    2.1  天然材料  本身来源于生物机体，具有良好的细胞亲和力，能为细胞生长、繁殖、分化提供近似体内组织发育的ECM支架条件，其生物相容性、顺应性以及免疫排斥性低等特点优于合成材料。天然生物材料分为大分子结构材料，如胶原、甲壳素等；脱细胞组织基质材料，如脱细胞真皮基质、脱细胞血管基质等。他们本身有的包含许多生物信息，能够提供细胞所需的信号，对细胞的维持和粘附具有优势。Heureux等在含有抗坏血酸的培养系统中，培养人平滑肌细胞，形成一薄层后再卷曲塑型为具有三维结构的管状，在其内表面种植内皮细胞，外层种植成纤维细胞构建了具有良好的力学特性，抗破裂压为2000mmHg的全生物化组织工程血管，动物体内短期移植显示易于手术操作，缝合性良好［18］。国内张炎等［19］采用以酶消化为主的方法制备猪颈总动脉脱细胞支架，再种植犬胸主动脉的平滑肌细胞，培养4周，经组织学染色和电镜观察显示：在猪颈总动脉脱细胞支架上，犬血管平滑肌细胞大量生长，组织学和电镜结构与正常血管壁结构类似。结果表明，成功地构建了全生物化组织工程血管。Borschel［20］从鼠髂动脉获取脱细胞血管基质，再种植鼠血管内皮细胞，将制备的组织工程血管植入同基因鼠股动脉，术后未抗凝治疗，4周后其通畅率为89%，组织学染色可见其腔面完全内皮化，并见向血管壁长入的平滑肌细胞，为小直径（＜3mm）血管移植提供了一种可能的方法。

 2.2  人工合成材料  分为非生物降解材料和可生物降解材料两种。由于非降解材料的许多不足，如支架材料不能降解，构建的血管不具备血管收缩性且易发生吻合口处内膜增生，非降解材料逐渐被淘汰。可生物降解材料常用的有聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸（PLA）、PGA与PLA共聚物（PLGA）等。用此类材料为支架构建的血管，有良好的组织相容性和可塑性，在完成一定时间的机械支撑作用后，在体内可逐渐分解为小分子物质，降解速率和三维结构易于调控；缺点是工艺复杂，价格昂贵，降解产物如不能立即吸收散去，仍然会刺激局部组织。Nillason等用PGA为支架成功构建的血管，经检测生物力学特性，其血管抗破裂压2000mmHg，抗缝合强度90g，胶原含量超过50%。移植于猪的髂动脉后血管通畅良好［21］，初步达到了较好的结果。但经进一步研究发现PGA为支架机械支撑力较弱，不能抵抗平滑肌细胞产生的收缩力，而且其降解速度快，很难维持预先设计的形态。在压力较高的循环系统中将难以耐受压力而形成动脉瘤。聚羟基乙酸顺应性不佳导致湍流易形成吻合口血栓或内膜增生。Xu等［22］将聚L丙交酯和聚已酸内酯按3∶1的比例合成了可降解的纳米纤维共聚物［poly(llactidcoEcaprolactone),P(LLACL)］其纤维直径为500nm，具有生物血管中层细胞及纤维原定向生长的微环境结构。将SMCs种植于P（LLACL）支架上，发现SMCs沿P（LLACL）纤维纵轴粘附、迁移并表达出梭状、具有收缩功能的表型。并且发现平滑肌细胞骨架蛋白也沿着纤维方向分布、聚集，SMCs的粘附和复制能力也大为提高。这种高度模仿生物血管微环境的纳米纤维是一种理想的血管组织工程支架。但目前欠缺动物以及人体实验，其具体的应用还需进一步研究。Williamson［23］以聚乙酸内酯（PCL）和聚亚安酯（PU）做成血管支架，然后种植人脐带静脉内皮细胞到未经改性处理的支架上，发现内皮细胞对其有良好的黏附生长能力，并能形成单层，且分泌一氧化氮（NO）等功能不受影响，表明PCLPU有望作为一种良好的支架材料。

    2.3  复合生物材料  天然生物生材料和合成材料都存在一定的不足。将两者按照一定的方法予以组合可构建成一种复合基质，可以发挥两者的各自优势。高分子材料可以提供一个稳定的环境并且可以塑造成各种形状，生物材料在维持组织完整、保护实质细胞、介导信号传导、调控细胞表型、诱导细胞黏附、增殖、分化和移行等方面具有不可忽视的作用。熊猛［22］通过用交联胶原包埋处理聚羟基乙酸（Polyglycolic acid,PGA），形成胶原加聚羟基乙酸管形支架，并接种牛血管内皮细胞于其内腔面，采用动态旋转培养技术体外培养10d，该支架具有一定弹性和韧性，在培养液中，能较长时间保持形状，内皮细胞在其内表面形成较完整内皮细胞层，覆盖率约72.6%±3.5%，表明此支架可以作为组织工程技术并造血管的较理想支架之一。He［24］等以胶原和可降解的纳米纤维共聚物［poly(llactidcoEcaprolactone),P(LLACL)］按70∶30的比例制备血管支架，其纤维直径为100~200nm，并种植人的冠状动脉内皮细胞体外静态培养，结果证实细胞能在上面良好生长，具备良好的黏附能力，能保持原来的细胞表型，表明有望作为血管组织工程理想的支架材料，但其体内生物降解性能及机械强度等尚需进一步研究。

    3  组织工程

　血管三维培养的研究组织工程血管的三维培养包括静态培养和动态培养。静态培养是指种子细胞与支架材料在静止状态、无特殊压力和环境变化的条件下所进行的培养；动态培养包括在生物体内的培养和体外模拟生物体内反应即生物反应器内的培养。传统的静止培养方法在应用中已暴露出缺陷［25］。由旋转生物反应器发展成的旋转细胞培养系统，使培养液和培养物做近似自由落体的运动，从而模拟一种微重力环境，能使培养物始终处于悬浮状态而又避免了较大的剪切力和气泡的产生，系统中的微载体受到的最大剪切力仅为6×10-6N/cm2。通过降低转速和减少剪切力可以减少细胞的凋亡，促进增生［26］，可明显促进混合细胞在支架材料上的黏附，形成均匀的组织。研究表明血流的物理信号刺激对血管组织成熟具有重要意义［27］。应用仿生的生物反应器可以明显改善细胞外基质的成分并增加物理强度［28、29］。陈兵等［30］以人血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞为种子细胞种植到三维结构的胶原蛋白几丁聚糖骨架分别在体外静态培养及生物反应器培养，表明两种方法均可以促进种子细胞增殖，两组间无明显差别，但生物反应器组胶原蛋白含量明显增高，且细胞的排列更有方向性，以构建的工程组织补片修复SD大鼠肾下腹主动脉人为缺损。存活6只大鼠生活状态正常，到术后10d未见破裂或动脉瘤形成，说明该工程组织具有相当的抗破裂强度。

    4  问题和展望

    血管组织工程近年来发展迅速，但是如何解决种子细胞来源少、体外构建自体血管的时间较长的问题；如何在较短时间内完成干细胞的分离、纯化、倍增，从而达到临床应用要求的问题；如何在支架材料机械强度、降解速率和组织形成速率三者间找到一个最佳的平衡点；如何开发具有良好生物活性对人体又无损害的生物材料；如何充分运用血液动学的作用构建具有收缩功能及可生长性的血管；如何使体外构建的人工血管能在体内保持原有的结构和功能等依然是研究热点。体外多能干细胞的培养是一种新方法，能产生适应不同人体需要的种子细胞，将最终取代自体血管细胞，成为体外构建血管的丰富的细胞来源，以胶原蛋白充当支架以及纳米结构的可降解材料充当支架的全生物型组织工程血管体外构建的成功，为心血管外科临床提供理想的血管替代物将成为可能，相信随着组织工程技术的不断发展，组织工程血管一定会得到广泛的应用。

　参  考  文  献

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