内皮祖细胞与血管再生

内皮祖细胞与血管再生

(王磊,王盛,管珩)   1山东大学齐鲁医院  普外科  （山东  济南  250012）

2首都医科大学附属北京安贞医院  血管外科  （北京  100029）

【关键词】内皮 祖细胞 新生血管化 生理性

    最近十年，干细胞研究取得了许多突破性的进展，并已成功地在人体或动物的各个器官中分离出了干细胞，包括骨髓、外周血、脑、肝脏，生殖器官等。内皮祖细胞（Endothelial precursor cells,EPCs）也已经成功地从骨髓及外周血中分离出来。研究发现，EPCs与造血干细胞有共同的前体细胞，它参与生理或病理的新血管生成，对其表面标志、动员、定向诱导分化及其在机体血管新生、心血管疾病与肿瘤治疗中的作用进行了广泛的研究。

    1  EPCs与新血管生成

　新血管生成包括两个基本过程，即血管新生（vasculogenesis）和血管生成（angiogenesis）。血管新生成是指内皮前体细胞，即成血管细胞分化成内皮细胞形成原始血管网的过程。血管生成是指从已存在的血管以生芽方式长出新毛细血管的过程。胚胎时期机体通过血管新生和血管生成两个过程形成新血管，成年后新血管的形成起先被认为仅由血管生成过程所形成，即由预先存在的内皮细胞增生和迁移所控制，但通过对外周血EPCs的观察和研究［1，2］，人们对于生后新血管形成的理解有了新的认识，即不仅存在血管生成，也包括血管新生。

    2  成人中EPCs的概况

    2.1  成人循环中EPCs存在的证据  在胚胎，有证据显示造血干细胞（hemopoietic stem cells,HSCs）和EPCs起源于共同的前体细胞――成血管细胞［3，4］。在胚胎发展过程中，多个血岛先形成一个卵黄囊毛细血管网［5］，它是动静脉血管系统基础，并最终形成早期的血液循环。那些能产生造血细胞的HSCs位于血岛中央，而EPCs即成血管细胞则位于血岛的外围。除了这种排列上的关系，HSCs和EPCs还具有共同抗原，包括CD34，血管内皮生长因子受体2（VEGFR2），Tie2，CD117及干细胞抗原1（Sca1）［6］。造血干细胞存在于外周血及骨髓中，人们便开始考虑与之关系密切的EPCs可能也存在于上述组织中。最近，人们使用胚胎期EPCs和HSCs共有的抗原VEGFR2，CD34及CD133将EPCs成功地从循环单个核细胞中分离出来［1，7，8］。在体外，这些细胞分化成不同的内皮系细胞，在动物缺血模型中，异种的、同种的、自体的EPCs已证明可参与新血管生成。最近，有报告从脐带血中分离出来的EPCs可在体内及体外分化成内皮细胞［9~12］。

    2.2  循环中EPCs的分离及诱导分化  目前，尽管EPCs跟HSCs有共同的表面标记物如AC133、CD34或VEGFR2，但还是无法从原始的HSCs分离出“未成熟EPCs”。目前认为，在循环中EPCs存在于表达AC133和VEGFR标记物的CD34阳性的亚细胞群中［8］。循环中的EPCs表达干/前体细胞标记物，如CD34或VEGFR2，但无AC133，同时开始表达内皮系的特殊标记物，如VE粘钙蛋白或E选择蛋白。另一方面，随着定型和分化成造血干/前体细胞，AC133和VEGFR2的表面标记物逐渐消失，这些干/前体细胞标记物没有在分化成的造血细胞上表达。AC133是区分未成熟EPCs或原始HSCs与循环EPCs的标记物。而区分EPCs与造血干/前体细胞，可以采用VEGFR2、VE粘钙蛋白或E选择蛋白。另外，循环的EPCs也不能表达单核细胞或骨髓的标记物，如CD14或CD15。因此，循环EPCs可以通过CD34、VEGFR2和（或）VE粘钙蛋白的抗原性选择分离出来，循环未成熟EPCs则可以通过AC133分离。EPCs和HSCs共有许多表面标记物，通常认为EPCs包含从成血管细胞到完全分化的内皮细胞（EPCs）的不同阶段的一群细胞，因此有许多不同的分离EPC的方法报道［1，2，8~11］。此后，研究者发现，体外通过碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFCF）、胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor1,IGF1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等生长因子对细胞分化进行诱导和控制，体外培养可分化出内皮细胞谱系，并于体内证明其具有生成血管能力，表达相应的细胞的细胞标志，用Fvl11/vWF染色，证实其具有内皮细胞的特征，说明了EPCs是CD34+细胞重要亚群，而且体外在VEGF与bFGF参与下能有效地扩增［13］。目前经常先用密度梯度离心法分离出骨髓或外周血单个核细胞，然后采用免疫磁珠等办法分选出CD34+细胞，在含有VEGF、IGF1、bFGF的培养液中培养，在各种生长因子诱导下得到贴壁细胞就是EPCs。另外，因为AC133可以区分成熟内皮细胞及内皮祖细胞，所以也可以应用AC133来作筛选，分离出AC133+细胞，然后再进行诱导分化，也可以得到EPCs，而且可以排除血管壁脱落的成熟内皮细胞。

    2.3  EPCs的动员  骨髓来源的EPCs参与生理及病理的新血管生成已经被各种动物实验所证实。研究表明组织创伤能动员造血系统中的造血细胞及多潜能干细胞或前体细胞。最近的研究显示骨髓来源的EPCs对缺血组织有自然的反应。有学者建立大鼠后肢缺血模型，发现随着大鼠后肢缺血的发展，骨髓来源的EPC更多地参与了角膜血管的新生［14］。这个发现表明在组织缺血时EPCs可内源性地被动员并参与血管新生，加强组织修复，这些结果最近在人身上得到证实，在烧伤，冠脉搭桥或急性心梗病人中发现了EPC的动员［15］。在发现EPCs可以被内源性动员之后，人们开始考虑EPCs的外源性动员也是增强EPCs定居群的一个有效方法。已有的研究证实粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）能刺激造血前体细胞和骨髓系细胞，但近来发现对EPC的动力学也有潜在的刺激作用。这种细胞因子通过传递诱导EPC动员并增强了严重缺血组织的血管新生及角膜血管生成［14］。EPCs动员到外周血液循环的确切机制尚不清楚，但可能是模仿了胚胎发展中的某些方面。在胚胎血管生成起关键作用的VEGF最近证明是成人EPC动力学的一个重要刺激因素。有人先是在鼠［16］随后在心肌缺血的病人中［17］证实VEGF能够促进血管新生，其中主要是通过动员骨髓来源的EPCs。

    3  EPCs在缺血性疾病中的应用

    1999年，Isner等［18］提出了“治疗性血管新生”概念，为缺血性疾病的治疗提供了新思路。其中干细胞及基因治疗近几年发展尤其迅速。在体外，干细胞具有自我更新及分化成器官特定的细胞类型的能力。当置于体内，这些细胞则被提供适当的环境以使它们能重构器官系统。有研究用培养扩增的EPCs的细胞治疗能成功地促进缺血组织的血管新生。目前应用EPCs治疗缺血性疾病主要有两种制备EPCs的方法，一种是采用新鲜制备的EPCs，另一种是在体外培养扩增的EPCs。Shatteman等将新鲜分离的CD34单核细胞注射到后肢缺血的糖尿病裸鼠体内，发现促进了肢体血流的恢复［19］。Schatteman等制作了免疫缺陷大鼠的后肢缺血模型，并经静脉移植了人EPCs，结果同对照组相比，移植组大鼠肢体坏死率和自动截肢率减少了50%［20］，这为在肢体严重缺血的动物模型中应用外源性EPCs挽救受损的血管新生提供了新的证据。Murohara等也有类似报道，应用原位移植入脐血来源的EPCs也促进了裸鼠后肢缺血模型的血管新生［10］。Akita等［21］用低氧在体外诱导培养EPC，然后移植给免疫缺陷的裸小鼠缺血下肢，显示这些细胞在体内促血管新生的能力明显示增强。同样，给心肌梗死后的患者注入外周血来源的EPCs或骨髓单核细胞能显著提高心脏功能［22］。此外，有的研究中心还采用没有选择的所有骨髓细胞或骨髓单个核细胞包括未成熟EPC诱导血管新生的方法来治疗缺血性疾病。几个实验报道将自体骨髓应用到兔［23］或鼠［24］后肢缺血模型及猪心肌缺血模型［25，13］中，能增加缺血组织的血管再生，主要是通过产生血管生长因子，部分通过细胞在原位分化为EPCs/Ecs。尽管局部输送这些主要由炎性白细胞组成的细胞群还没有长期安全有效的数据，但一些中心已将这种方法应用于临床病人，国内外均有报道，初步的报道显示能显著改善缺血组织的血供，但还缺乏长期的疗效评价。

4  EPCs治疗

　缺血性疾病的局限和存在的问题从健康志愿者的外周血单个核细胞体外扩增培养EPCs，每10ml血产生 5.0×106个细胞。动物实验［20］显示受体动物需要接受每克体重0.5~2.0×104人EPCs的系统注射才能在缺血肢体得到满意的再灌注。根据这些数据粗略地推断一个人需要12L血才能获得足够数量的EPCs来治疗严重的肢体缺血。另外，许多临床病人因老龄、糖尿病、高胆固醇血症等造成循环中EPCs缺乏，局限了早期EPC移植。由于缺乏特异性的表面标记，目前分离、纯化EPCs尚有一定难度。血管内皮祖细胞与造血干细胞来自同一祖先细胞，因此它们分享多个共同的抗原，如AC133、CD34或VEGFR2，目前还是无法从原始的HSCs分离出“未成熟EPCs”。因此如何寻找新的特异性标记物，从而得到纯度更高的EPCs是目前EPCs治疗的另一问题。理论上讲，将骨髓或外周血干细胞分离后，在体外纯化、扩增再进行移植经未经处理的干细胞移植应该会后更好的效果。但由于安全及伦理方面的原因，目前在临床上用于治疗的仅仅是骨髓或外周血单个核细胞，因此能否克服安全及伦理方面的阻碍，将分离、纯化的EPCs应用于临床是当前面临的另一挑战。另外由于EPC的功能和动员机制在某些特定的疾病状态中可能受到损害，因此寻找能减轻缺血性疾病中潜在的EPC功能衰竭方法或者改善EPCs功能方法也是干细胞研究者面临的一个难题。

    5  EPCs细胞治疗新方法

　展望干细胞移植是21世纪最先进的技术之一，并在最近十年得到了迅速的发展，但如前所述几方面的问题又限制了它的发展，要想取得更好的疗效，就要获得更高质量和数量的EPCs，就必须要进行技术上的改进，如采用更有效的EPC提纯和扩增的方法。在一些因骨髓损害而不能应用自体来源EPCs的病人，可以应用从脐血分离出或从组织特定干/前体细胞及胚胎干细胞分化成的EPCs，但须进行优化选择。还可以采用一些附属的方法（如生长因子补充）来促进骨髓来源的EPCs动员。基因治疗是治疗缺血性疾病的另一项新技术，血管内皮生长因子（VEGF）在治疗缺血性疾病中的作用已经得到肯定。与成体组织相比，干细胞移植的优势之一即在于其易于改造，可以作为基因治疗良好的靶细胞。因此将EPC细胞治疗与基因（如VEGF）治疗联系起来治疗缺血性疾病是一种有前途的方法。并且已经取得了初步的进展［19］。随着自体细胞治疗与基因修饰的概念的出现，EPCs表现出了巨大的潜能，EPCs再生医学的临床应用必将得到更大地发展。

　参  考  文  献

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