脂氧合酶抑制剂NDGA对乳腺癌MCF

作者:刘焕涛,唐鲁兵,马榕

        【关键词】  乳腺肿瘤  脂氧合酶抑制剂  CD44V6 VEGF

     【摘要】目的：探讨NDGA对乳腺癌MCF7细胞VEGF和CD44V6表达的影响。方法：将乳腺癌MCF7细胞系培养至对数生长期，分别以0、1、10、100μmol/L的NDGA处理48h后，RTPCR法检测细胞VEGFmRNA的表达水平，流式细胞仪检测细胞CD44V6的表达情况。结果：在1、10、100μmol/L的NDGA作用下，3组VEGFmRNA和CD44V6的表达显著低于对照组（F=2996.13,P＜0.001;F=3435.08,P＜0.001）。结论：NDGA明显下调MCF7细胞VEGFmRNA和CD44V6的表达，抑制肿瘤细胞的侵袭转移能力。

       The effect of lipoxygenase inhibitor (NDGA) on the expression of VEGF and CD44V6 in breast cancer MCF7 cells

    LIU Huantao,TANG Lubing,MA Rong

    Department of Breast Surgery,Qilu Hospital of Shandong University(Jinan 250012,China)

    【ABSTRACT】Objective:To explore the effects of VEGF and CD44V6 on breast cancer MCF7 cells by NDGA.Methods:MCF7 cells in the logarithmic growth state were selected and measured.There were four cell groups(concentration:0,1,10,100μmol/L)in the experiment.After 48h treatment of NDGA,the expression of VEGFmRNA was measured by RTPCR and the expression of CD44V6 was examined by flow cytometry.Results:After treatment of NDGA,the expressions of VEGFmRNA and CD44V6 in NDGA groups were significantly lower than that of the control group(F=2996.13,P＜0.001;F=3435.08,P＜0.001).Conclusion:NDGA can influence the invision and metastasis on MCF7 cells by means of the downregulated expression of VEGFmRNA and CD44V6.

    【KEY WORDS】Breast neoplasms?Lipoxygenase inhibitors?CD44V6?VEGF    NDGA

　（nordihydroguaiaretic acid,去甲二氢愈创木酸）能够抑制花生四烯酸通过脂氧合酶途径进行代谢，是脂氧合酶的强烈抑制剂，已有NDGA诱导结肠癌细胞凋亡的报告［1］。我们研究发现，NDGA通过下调MCF7细胞端粒酶hTERTmRNA及bcl2表达，进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡［2］。本文以VEGF和CD44V6为侵袭转移指标，探讨NDGA对乳腺癌MCF7细胞侵袭和转移能力的影响。

    1  材料和方法

    1.1  细胞系和材料  乳腺癌细胞系MCF7由山东大学细胞生物学教研室惠赠。VEGF引物序列：上游引物5’TTGCTGCTCTCTACCTCCAC3’下游引物5’AATGCTTTCTCCGCTCTG3’扩增片段长度为418bp。βactin作为内参照：上游引物5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’下游引物5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’扩增片段长度为539bp。上述引物均由上海博亚生物工程有限公司合成。RNA提取试剂盒、dNTP、RNasin、MMLV逆转录酶及TaqDNA聚合酶，均购自于上海生工生物公司。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养与处理  MCF7细胞培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，青霉素、链霉素浓度均为100U/ml，NaHCO3为2g/L，置于37℃、5%CO2的湿化培养箱，在25cm2/50ml一次性塑料培养瓶中进行传代培养。NDGA处理组浓度分别为0、1、10、100μmol/L，共4组。将处于对数生长期且长满瓶底80%~90%的MCF7细胞用0.25%胰蛋白酶进行消化，待细胞形态变圆、体积变小时倒掉胰蛋白酶，加入含血清的培养液终止消化，轻轻吹打制成单细胞悬液，分装于多个培养瓶，补足培养液继续培养24h，取4组生长良好的细胞，倒掉培养液，处理组各加入NDGA浓度分别为1、10、100μmol/L的培养液5ml，对照组补足培养液。继续培养48h，消化离心收集标本待检。

    1.2.2  RTPCR法分析VEGFmRNA的表达  将各浓度NDGA处理48h和未处理的细胞消化后离心（1000r/m,5min），PBS洗涤后再离心一次，弃上清，收集细胞置于-80℃保存备用。应用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，然后进行逆转录反应和PCR反应，对凝胶电泳结果进行定量分析，计算相对系数。相对系数=VEGFmRNA表达强度/βactin表达强度。根据相对系数作统计学分析及直方图，计算VEGFmRNA抑制率=（对照组-治疗组）/对照组×100%。

    1.2.3  流式细胞仪检测CD44V6的表达  将各浓度NDGA处理48h和未处理的单细胞悬液放入离心管离心（1500r/m，5min），PBS漂洗后再离心5min，弃上清，加入70%冷乙醇2ml移入EP管，4℃固定。调节细胞悬液的浓度为106~107/ml，取两支试管各加待测细胞悬液500μl，其中一管加20μl单抗CD44V6FITC工作液，另一管加20μl阴性对照单抗IgG1FITC工作液，均置于室温下避光20min，2000r/min离心5min，去上清，加入PBS500μl，上机测试，以CD44V6的荧光强度来表示表达水平。

    1.3  统计学处理  定量资料数据以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析（Dunnett t检验），以P＜0.05为有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  VEGFmRNA表达  MCF7细胞经过NDGA处理48h后，各处理组与对照组差异有统计学意义（F=2996.13,P＜0.001），表明NDGA抑制细胞VEGFmRNA的表达，且存在一定的剂量依赖关系（表1，图1）。内参照βactin表现为扩增片段长度为539bp、宽窄及深浅基本一致的条带，而VEGFmRNA表现为扩增片段长度为418bp、宽窄和深浅不一的条带。随着NDGA浓度的逐渐增加，VEGF的条带逐渐变窄变浅，提示VEGFmRNA的表达受NDGA的抑制而逐渐下降（图2）。表1  NDGA对MCF7细胞VEGFmRNA表达的影响（略）

    2.2  CD44V6的表达  NDGA作用MCF7细胞48h后，各处理组与对照组差异有统计学意义（F=3435.08,P＜0.001），表明1~100μmol/L的NDGA对CD44V6有抑制作用（表2和图3）。相关分析结果显示，CD44V6与NDGA浓度之间的相关系数为-0.581，P值为0.018＜0.05，有显著意义，所以我们可以认为CD44V6与浓度之间呈负线性相关，NDGA的浓度越大，对CD44V6的抑制作用就越强，呈现剂量依赖关系。表2  NDGA对MCF7细胞CD44V6的影响（略）

 3  讨  论

　新生血管化是恶性肿瘤组织侵袭的重要基础，血管内皮细胞的增殖是血管生成过程中最基本的环节，这个过程受几种胞外信号因子的调节，目前已知有多种促血管生长因子参与诱导和调节肿瘤新生血管的形成，其中以VEGF与血管生成的关系最为密切，最具有代表性［3］。抑制VEGF表达可能是NDGA抗肿瘤机制之一。证据表明，血管生成的抑制物有抗转移效应［4］。Mario等研究表明，NDGA能够显著下调人恶性胸膜间皮细胞VEGFmRNA的表达，同时降低VEGF蛋白的生成量，阻滞细胞增殖，诱导细胞凋亡［5］。我们的实验结果显示，MCF7细胞存在VEGFmRNA的高表达，经NDGA作用后，VEGFmRNA的表达水平明显降低，有剂量依赖效应，这表明NDGA对MCF7细胞表达VEGF的抑制作用至少是在转录水平的。由于VEGF基因最终通过蛋白来发挥作用，在转录、翻译过程中存在多级调控，因此我们还不能简单认定VEGFmRNA与VEGF的蛋白生成量之间存在因果关系，还需进一步的研究探讨。VEGF对内皮细胞的信号调节作用主要通过两种酪氨酸激酶受体来完成，它们是VEGFR1和VEGFR2。VEGFR2与内皮细胞的分化和增殖作用密切相关，是血管生成过程中的主要调节者［6］。VEGF与受体结合后，酪氨酸激酶被激活，血管内皮细胞增殖生长，形成新的血管内膜，为肿瘤细胞的生长提供必要的营养成分。如果能有效抑制VEGF及其受体的表达，将对抑制内皮细胞增殖及肿瘤血管的生成具有重要意义。Colavitti等［7］研究发现，VEGF与内皮细胞膜表面的受体VEGFR2结合后，通过受体的磷酸化作用，激活下游信号传递系统的启动子，诱导内皮细胞线粒体活性氧的产生，有利于线粒体呼吸链的传递，促进细胞分裂增殖，而脂氧合酶抑制剂NDGA能显著降低活性氧的产生，其机制可能是通过抑制细胞膜VEGFR2的磷酸化作用来完成的。文献报道［8］，NDGA能有效抑制内皮细胞及胶质瘤细胞诱导的内皮细胞的增殖、迁移等血管生成效应，同时能够降低内皮细胞VEGFR2表达水平，此抑制作用可能是NDGA抗血管生成的重要分子基础。    细胞表面分子CD44V6是一种细胞粘附因子，与细胞的迁移运动有关，在肿瘤的生长和转移方面起重要作用［9］。研究表明，正常导管及腺泡上皮细胞的CD44V6呈阴性表达，从正常组织、导管内乳头状瘤、乳头状瘤癌变、导管内癌、浸润性导管癌的上皮细胞到癌细胞，CD44V6的表达强度及阳性率呈上升的趋势［10］。本研究结果显示，正常对照组MCF7细胞CD44V6的荧光强度为134.41±1.88，阳性细胞数为50.35±1.68%，表明MCF7细胞存在CD44V6的表达，但表达水平随NDGA浓度的增加而逐渐下降，且呈现剂量依赖关系。这说明NDGA能够下调乳腺癌MCF7细胞CD44V6的表达水平，抑制肿瘤细胞的侵袭转移能力。我们在以往的研究中发现［11］，NDGA抑制MCF7细胞表面的超微结构，使细胞与细胞外基质的粘附性和细胞的运动能力下降，是否与NDGA下调CD44V6的表达，影响细胞内骨架蛋白的构像和分布，进而影响肿瘤细胞的运动能力，促进肿瘤转移的发生有关，还有待于进一步研究探讨。

    参  考  文  献

    ［1］夏光涛，张源潮，武森森，等.脂氧合酶抑制剂NDGA对HT2P结肠癌细胞诱导调亡的研究［J］.中国现代普通外科进展，2006，9（1）：2729.

    ［2］刘焕涛，孙靖中，唐鲁兵.脂氧合酶抑制剂NDGA对乳腺癌MCF7细胞端粒酶和bcl2的影响［J］.中国现代普通外科进展，2005，8（6）：358360.

    ［3］Lund EL,Spang TM,Skovgaard PH,et al.Tumor angiogenesis:a new therapeutic target in gliomas［J］.Acta Neurol Scand,1998,97(1):5262.

    ［4］陈晰.VEGFD及VEGFR3在乳腺癌淋巴道转移中的作用［J］.中国现代普通外科进展，2005，8（2）：6971.

    ［5］Mario R,Alfonso C,Michele N,et al.5Lipoxygenase regulates malignant mesothelial cell survival:involvement of vascular endothelial growth factor［J］.FASEB J,2001,15:23262336.

    ［6］Nor JE,Christensen J,Mooney DJ,et al.VEGFmediated angiogenesis is associated with enhanced endothelial cell survival and induction of bcl2 expression［J］.Am J Pathol,1999,154(2):375384.

    ［7］Colavitti R,Pani G,Bedogni B,et al.Reactive oxygen species as downstream mediators of angiogenic signaling by VEGFR2/KDR［J］.J Biol Chem,2002,277(5):31013108.

    ［8］孙慧勤，陈意生，史景泉，等.去甲二氢愈创木酸对VEGF及其受体KDR基因表达影响的研究［J］.第三军医大学学报，2001，23（3）：268271.

    ［9］Tran TA,Kallakury BV,Sheehan SB,et al.Expression of CD44 standard form and variant isforms in nonsmall cell lung carcinoma［J］.Hum Pathol,1997,28:809814.

    ［10］何洁华，梁小曼，候景辉，等.乳腺导管内乳头状瘤及其癌变组织CD44V6蛋白表达的研究［J］.癌症，2002，21（6）：615618.

    ［11］刘焕涛，孙靖中，马榕，等.脂氧合酶抑制剂对乳腺癌细胞MCF7增殖和凋亡的影响［J］.中华实验外科杂志，2005，22（8）：10091010.

  山东大学齐鲁医院  乳腺外科  （山东  济南  250012）