针灸血清”对乳腺癌MCF

作者:李岩,郭刚,李彬,史秀芳

1山东大学齐鲁医院  针灸科  （山东  济南  250012）

2山东省中医药研究院  （山东  济南  250014）

3山东邹县发电厂职工医院  （山东  邹城  273500）      【关键词】  针刺 灸法 乳腺肿瘤 细胞凋亡 细胞周期

   【摘要】目的：观察针灸对乳腺癌细胞凋亡及细胞周期的影响。方法：针灸刺激雌性Wistar大鼠双侧足三里、三阴交、内关穴，抽取大鼠“针灸血清”分别与MCF7细胞混合培养，分为电针组、艾灸组和对照组。MTT法检测细胞生长情况，72h后流式细胞技术检测细胞凋亡率及Fas表达率。结果：MCF7细胞Fas表达率明显增高，72h达57.70%；MCF7细胞生长受到明显抑制，12h、24h、72h抑制率分别达17.55%、24.71%和31.85%；作用72h后的细胞凋亡率分别为1.07%、8.72%、10.18%,与艾灸组相近，均明显高于对照组（P＜0.05）。结论：“针灸血清”作用于MCF7细胞可能通过增加Fas的表达率来诱导细胞凋亡。

       The effect of acupunctural and moxibustional therapy on the apoptosis of breast cell MCF7

    LI Yan1,GUO Gang1,LI Bin2,SHI Xiufang3

    1Acupuncture and Moxibustion Department Qilu Hospital of Shandong University(Ji

    nan 250012,China)

    2Shandong Acdemy Institute of Traditional Chinese Medicine(Jinan 250014,China)

    3Hospital of Shandong Zouxian Powerplant(Zoucheng 273500,China)

    【ABSTRACT】Objective:To observe the effect on the apoptosis of breast cancer cell MCF7 with acupunctural and moxibustional therapy.Methods:Zusanli and Sanyinjiao neiguan in both sides of female Wistar mice were acupunctured and moxibusted.MCF7 cell was cultirated with the serum.To detecte the cytoxicity with MTT,and detecte the apoptosic rate and Fas expression rate with flow cytometry after 72 hours.Results:The Fas expression was obviously increased upto 57.70% after 72h.The proliferation of MCF7 was inhibited remarkably.The inhibition rate were 17.55%,24.71% and 31.85% after 12h,24h and 72h.The apoptosic rate were 8.72% and 10.18% after 72h,remarkably higher than the control group(P＜0.05).Conclusion:Acupunctural and moxibustional serum could increase Fas expression rate to inhibit proliferation of MCF7 cell and induce its apoptosis.

    【KEY WORDS】Acupuncture?Moxibustion?Breast Neoplasms?Apoptosis?Cell cycle   

　乳腺癌在我国的发病率不断增高，寻找有效的治疗方法具有深远的意义［1］。针灸在一定程度上能抑制肿瘤的生长，对恶性肿瘤具有一定的治疗作用，可缓解临床症状，减轻放、化疗后的副反应，改善机体免疫功能，提高患者的生活质量。针灸腧穴而采集的“针灸血清”是近年来针灸研究中提出的一种新的研究思路和方法。本文通过应用针灸血清培养乳腺癌细胞MCF7，观察针灸对乳腺癌细胞凋亡情况及细胞周期的影响，为寻找针灸治疗乳腺癌的途径和方案以及为探讨针灸抑瘤机制提供线索。

    1  材料与方法

    1.1  材料  乳腺癌细胞株MCF7由山东中医药大学细胞室提供。雌性Wistar大鼠30只，体重250g左右，由山东大学医学院动物实验室提供。RPMI1640购自美国GIBCO公司，新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所，二甲基亚砜分析纯购自北京亚太精细化工公司，MTT购自SIGMA公司，Fas、异硫氢酸荧光素（FITC）标记的单克隆抗体IgG1及免疫阴性对照品IgG1FITC均为美国Pharmingen公司产品，由北京岳泰生物公司提供。FACScan型流式细胞仪为美国BD公司产品。

    1.2  方法

    1.2.1  针灸血清的制备［1］  选用雌性健康Wistar大鼠30只，随机分为空白对照组、电针组和艾灸组各10只。电针组和艾灸组分别用电针和艾灸的治疗方法在相当于“足三里”、“三阴交”和“内关”穴的部位进行治疗，电针组选用30号40mm毫针，直刺20~30mm，得气后接MODEL D68051型电针治疗仪，选用连续波，留针20min。艾灸组用雀琢灸法灸穴位20min，连续6d，每天2次，在最后一次治疗结束后1h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉取血，无菌分离血清，经56℃、30min灭活处理后，置-20℃冰箱备用。

    1.2.2  细胞培养  MCF7细胞株培养于RPMI1640培养液中，置37℃，5%CO2（体积比，下同）和饱和湿度下的培养箱中培养，2~3d胰酶消化传代1次，当细胞传至第4代、细胞生长良好、状态稳定时，用胰蛋白酶消化后，以2×105/cm2的密度重新种入30mm的6孔培养皿上，于37℃和5%CO2培养箱中培养24h。第2天用磷酸盐缓冲溶液（PBS）将细胞清洗2次，分别加入正常鼠血清、电针鼠血清、电针鼠血清继续培养72h。

    1.2.3  MTT法检测MCF7细胞抑制率  取对数生长期的MCF7细胞，胰酶分散计数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml，按每孔200μl接种于96孔板中（每孔细胞数为2×104个），置于37℃、5%CO2和饱和湿度下的培养箱中培养24d，贴壁后倒掉RPMI1640培养液，分为对照组和实验组，每一组设3个平行孔，分组如下：对照组（RPMI1640培养液中含10%正常鼠血清），电针组（RPMI1640培养液中含10%电针鼠血清），艾灸组（RPMI1640培养液中含10%艾灸鼠血清）。每一组分别加入血清200μl，再置培养箱中分别培养12h、48h、72h后，每孔加入5mg/ml MTT 20μl，继续培养4h后，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入二甲基亚砜150μl，振荡至结晶完全溶解，于酶联免疫检测仪上测定490nm波长的吸光度（A值），计算抑制率，由抑制率说明针灸血清对人乳腺癌MCF7细胞株的敏感性。抑制率（%）=（对照组A值-含药血清组A值）/对照组A值×100%。

    1.2.4  流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化  取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化经加入以上各组血清培养72h后的贴壁细胞，收集细胞数目分别约5×105，1000r/min离心5min，弃去培养液。经PBS漂洗2次后，加入冰预冷的70%乙醇固定，4℃过夜。 然后除去固定液，用3ml PBS溶液重悬细胞5min，1000r/min离心5min，弃去PBS溶液，加入PC缓冲液50μl，静置20min，再加入100μg/ml PI液10μl，PBS溶液480μl，室温避光30min后上流式细胞仪检测，Modifit软件（BD公司提供）分析数据。

  1.2.5  流式细胞仪检测Fas表达  取对数生长期的细胞，胰酶消化计数，37℃、5%CO2箱中培养24h，至细胞生长旺盛贴壁后，去掉培养液，分别加入以上各组血清培养液于CO2培养箱中继续培养72h。然后分别胰酶消化后离心，每支离心管中加入70%乙醇固定细胞，以PBS液漂洗2次后，再离心（1500r/m，5min）。取细胞悬液500μl，加入异硫氢酸荧光素标记的鼠抗人的单克隆抗体IgG1工作液20μl，另各取一支阴性对照品IgG1FITC，室温避光反应30min后，由流式细胞仪荧光检测。

    2  结  果

    2.1  针灸对细胞抑制率的影响  见表1。由表1可见，针灸大鼠血清对乳腺癌MCF7细胞的抑制率呈时间依赖性，电针组和艾灸组均能明显抑制MCF7细胞增殖（P＜0.05），但电针组的抑制率高于艾灸组（P＜0.05）。表1  3组血清在不同时间段对MCF7细胞的抑制率（略）

　　2.2  针灸对细胞凋亡和细胞周期变化的影响  见图1~3，表2。各血清作用72h后，直方图中均可见G0/G1期峰前的亚二倍体峰即凋亡峰，代表凋亡细胞群，以峰值高低代表凋亡细胞的比例。图1、2、3显示对照组、艾灸组和电针组的凋亡率分别为1.07%、8.72%、10.18%。由表2可以看出，各血清作用72h后，S期和G2/M期细胞数均明显减少（P＜0.05），对照组、艾灸组和电针组的凋亡率分别为1.07%、8.72%、10.18(P＜0.05)。针刺和艾灸都能抑制MCF7细胞增殖，且两者差异没有统计学意义（P＞0.05）。由表3可以看出，电针组和艾灸组大鼠血清对Fas的表达率明显高于对照组（P＜0.05），但电针组与艾灸组对Fas表达率的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。表2  3组MCF7细胞血清作用72h后细胞周期变化（略）表3  3组血清作用72h后MCF7细胞Fas表达

　3  讨  论

    诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的一种新的思路，而且治疗肿瘤的有效性主要表现在肿瘤细胞生长抑制和/或诱导凋亡［2，3］。本实验表明“针灸血清”能抑制乳腺癌MCF7细胞生长。“针灸血清”是近年来针灸研究中提出的一种新的研究方法，是指从针灸处理后的人或动物体上采集到的血清，作为效应物质加入到另一个反应系统中，同在体或离体器官组织、细胞或分子靶目标接触，通过它们的功能或形态学的改变，直接地观察针灸处理后的效应［4，5］。“针灸血清”研究方法可归纳为离体实验和在体实验两大类。本实验针灸大鼠血清离体作用于人的肿瘤细胞株，结果发现，针灸刺激Wistar大鼠双侧足三里、三阴交、内关穴后的大鼠“针灸血清”能使MCF7细胞抑制率升高，说明可以抑制体外肿瘤细胞生长。与正常对照组比较，MCF7细胞S期和G2M期百分率均明显降低，说明针灸血清能影响乳腺癌MCF7细胞增殖，抑制其生长。细胞凋亡在肿瘤发生、发展、转化和治疗过程中具有重要意义，许多抗肿瘤药物是通过诱导细胞凋亡而发挥作用的。本实验研究显示，针灸刺激大鼠双侧足三里、三阴交、内关穴，此大鼠“针灸血清”能诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡。其机制可能是针灸腧穴后，通过某种内在的生理调节机制，引起血清中Fas的表达率增高，从而诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡，发挥抑制肿瘤的作用。针灸疗法能促使经络畅通，气血调和，改善机体免疫功能，可产生不同程度的类药性作用。从这个角度讲，似可把针灸穴位比喻为“药物”，不具备药的外在形态却具有药的某种作用实质，这是针灸疗法最本质的特征之一。“针灸血清”可直接观察其功能或实验物形态学的改变，有利于拓宽针灸研究的领域，推动针灸作用及其机理研究，寻求一条治疗恶性肿瘤的独特道路。

    参  考  文  献

    ［1］唐汉钧.乳腺癌的中医临床与实验研究［J］.中医药学刊，2003，21（2）：168172.

    ［2］Elsmer E Williamson EA Zangand C,et al.Novel the rapeutic approach ligands for PPARa and retinoid receptors induce apoptosos in bcl2 positive human breast cancer cells［J］.Breast Cancer Res Treat,2002,74(2):155165.

    ［3］孙研琳，周庚寅.RNA干扰及其在乳腺癌研究中的应用［J］.中国现代普通外科进展，2005，8（4）：193195.

    ［4］陈汉平.东南久矣要张机――再谈“针灸血清”研究［J］.上海针灸杂志，2002（1）：20.

    ［5］孙德利，陈汉平.“针灸血清”的研究方法及意义［J］.浙江中医学院学报，1999（3）：59.