分泌性中耳炎中Foxp3~+CD4~+CD25~+T细胞的初步研究
发表时间：2014-09-24 浏览次数：1220次
分泌性中耳炎(oME)的免疫学发病机制至今尚未完全阐明,近年来,随着免疫调节性T细胞在慢性炎症领域研究的飞速发展,其在OME中的作用逐渐得到重视。既然成人oME有可能是上呼吸道黏膜的一种慢性炎症反应状态,发病过程中以CD4+CD25+T细胞为中心的免疫调节机制是否发挥作用?本研究通过流式细胞技术检测0ME患者外周血中CD4+CD25+T细胞的含量,旨在初步探讨调节性T细胞是否参与oME的发生发展。
1资料与方法
1.1临床资料。连续选取首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科门诊行鼓膜穿刺或入院行鼓膜置管的0M患者。本研究共选取oME患者36例,男22例,女14,年龄,平均(3806±1457)岁;正常对照组30例,年龄18~62岁,平均(3360±1350)岁;oME患者组与正常对照组在年龄分布上无明显差异(尸)005)。主诉多为听力下降,其次表现为耳闷、耳鸣,伴耳痛者较少,均无耳漏或体温升高。电耳镜检查见鼓膜内陷或膨隆,呈橙色、淡黄色或粉色,部分可见明显气液平或气泡。纯音听力试为轻、中度传导性听力损失,部分表现为混合性听力损失。声导抗测试显示鼓室压力图呈“B”型或“C”型,声反射消失。所有患者病史21d~3年,其中病程不满3个月者11例,为急性期组;病程≥3个月的25例,为慢性期组。首次接受鼓膜穿刺/置管者1,第2次及以上鼓膜穿刺/置管者24例。同时选取30例健康志愿者作为正常对照组,年龄18~62岁。所有对照者均排除过敏性疾病相关病史,结合病史询问和皮肤点刺试验,排除变应体质对实验结果的干扰。所有研究对象均排除糖尿病、结核等严重全身性疾病及鼻咽癌等恶性疾病,且近2周内无激素类药物使用史。
1.2实验方法。
1.2.1外周血标本采集。所有研究对象均抽取静脉血5ml,置于含肝素抗凝剂的采血管中,离心分离淋巴细胞后行流式细胞学检查。
1.2.2人外周血淋巴细胞获取。将5ml肝素抗凝血离心弃去血浆层,保留自细胞及红细胞层,制各细胞悬浮液缓慢铺到4ml人淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司),离心后吸取单个核细胞层。
1.2.3叉头状转录因子p3+(FOxp3+)CD4+CD25+T细胞免疫荧光染色(试剂盒购自Biolegend公司)。将以上所获淋巴细胞用200洌PBS悬浮后,分成100田/管,共2管,1管用于检测Foxp3+CD4+CD25+T细胞,另1管为阴性对照;向每管中加入20uI CD4PE-Cys/CD25PE标记抗体,混匀,避光,室温孵育20min;加入1ml PBs洗涤细胞,轻柔混匀,1000rpm/min离心8min,弃上清;每管中加入1mH×FOxp3Fix/Perm缓冲液(破膜剂),轻柔混匀,避光,室温孵育20min;1000rpm/min离心8mln,弃上清;用1m11×FOxp3Fix/Perm缓冲液洗涤细胞1次;用1m11×Foxp3FiX缓冲液(固定剂)悬浮细胞,避光,室温孵育15min。1000rpm/min离心8min,弃上清;用100"1×Foxp3FiX/Perm缓冲液悬浮细胞,向相应管中分别加入5洌AIexa FIuor human FOxp3抗体或5 lll AIeXa FIuOr mouse IgG抗体,避光,室温孵育30min;加1ml1×FOxp3Fix/Perm缓冲液洗涤细胞两次,1000 rpm/min离心8min。将所得细胞悬浮于05m11×FOxp3 FiX/Perm缓冲液中,置流式细胞仪上,设置参数进行细胞计数。
⒈⒊统计学方法。采用SPSs11.5统计软件包,各项数据用7±s表示,3组间均数的比较采用单因素方差分析(AN0VA),均以P<0.01为有显著性差异,P>005不具有统计学意义。
2结果
2.1 OME患者外周血及正常人外周血中Foxp⒊CD4+CD2⒌T细胞/CD4.T细胞的比例变化(FOxp3CD4+CD25+T/CD4+T)。人外周血中Foxp3+CD4+CD25+T细胞/CD4+T细胞流式细胞学检测结果(图1)。
2.2急性期组、慢性期组、对照组3组外周血中FoXp3+CD4+CD25+T/CD4+T细月包比.为(402±1^23)%、(621±23)%、(4、6±163)%,经单因素方差分析(ANOVA),结果表明,慢性期组外周血中Foxp3+CD4+CD25+T/CD4+T细胞显著高于急性期组,也显著高于正常人外周血(厂=7090,P(001);急性期组外周血中Foxp3+CD4+CD25+T/CD4+T较正常人低,但不具有统计学意义(P>005)。
3讨论
OME是中耳的常见病、多发病。若迁延不愈,可造成中耳黏膜持久的病理损伤,导致暂时或永久性听力损害,目前发病机制尚未完全阐明。随着“上下呼吸道炎症一致性”概念的提出,免疫反应在0ME发生发展中的作用日趋引起重视回。正常免疫系统存在专职的调节性T细胞,这些细胞的功能缺陷在变态反应性疾病的发病机制中发挥重要作用。其中CD4+CD25+T细胞的功能和作用机制因其特异性转录因子Foxp3的发现而备受关注。CD4+CD25+调节T细胞是CD4+T细胞的一个小的亚型,源于胸腺,在外周血和外周淋巴组织中占总CD4+细胞的5%~10%,作为一类具有功能的成熟T细胞亚型,大量研究提示,该细胞可通过细胞接触和分泌ILˉ10和TGF-β1两种机制抑制免疫反应、调节慢性炎症过程,与上呼吸道慢性炎症性疾病的发生发展有关u~剑。F。xp3作为CD4+CD25+T细胞的管家基因,是CD4+CD25+T细胞活化的特异性标志,可以有效减少CD4+CD25+表达重叠效应的干扰,更好反映机体CD⒋CD2⒌T细胞水平。
体外实验中Foxp⒊CD4+CD25+T细胞具有免疫抑制功能、T细胞无反应性和抑制性现象,此基因缺陷将导致免疫耐受缺陷、免疫功能紊舌L占本研究结秉显示慢性oME患者外周血中FOXp3D痨℃D25+ΠcD4+T细胞比例显著高于急性OME患者及正常叉寸只虱组,扶步云Foxp3+CD4+CD25+T/CD4+T细胞比例的变化可能与慢性oME病例的炎症持续状态有关,亦可以提示在迁延不愈的oME病例中,除咽鼓管机械性阻塞因素,免疫反应异常可能也是其重要原因。已有研究表明,慢性0M匚患者外周血中爸0表达水平显著升高囵。提示FOxp3+CD4.GD25+调节丁细胞可能通过调节lL-10表达水平或其他机制在慢性0R/lE的发展中起作用。本研究样本量有限,尚不足以阐明此类细胞在0ME发病中的确切作用机制。
作为本研究的延伸,下—步将通过检测中耳积液中Foxp3+CD4+CD2⒌T细胞数量变化更深入探讨此细胞在oME发病中的作用。目前细胞因子与0ME之间的关系一直是研究热点,也有动物实验证实某些细胞因子拮抗剂确实能减轻0Mε的病理变化。因此,使用细胞因子拮抗剂对抗细胞因子的作用成为治疗oME的新设想网。相信该领域的进一步研究能对0MEj台疗,特别是迁延不愈慢性病例的治疗带来曙光。
参考文献
[1]李希平,戴海江,牟文清.分泌性中耳炎的治疗现状与思考[J].中国耳鼻咽喉头颈外科.2007(08)
