茶多酚对脑缺血大鼠脑内少突胶质细胞的影响
发表时间：2010-01-25 浏览次数：679次
茶多酚对脑缺血大鼠脑内少突胶质细胞的影响作者：陈应柱, 田野, 张志琳，包仕尧 作者单位：215004苏州大学附属第二医院神经科［陈应柱(现在江苏省苏北人民医院), 张志琳, 包仕尧］, 肿瘤放疗科(田野) 【摘要】 目的 观察茶多酚对脑缺血大鼠脑内少突胶质细胞(OLG)的影响。方法 将雄性SD大鼠随机分为假手术组、对照组、茶多酚组。制备全脑缺血模型后，茶多酚组大鼠被分为3组分别按剂量25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg茶多酚予以腹腔注射，每日1次，连续7 d；免疫组化法检测各组大鼠皮质前体OLG、未成熟OLG及成熟OLG的变化。结果 与假手术组比较，对照组皮质前体OLG明显增多，未成熟OLG及成熟OLG明显减少(均P<0.05)；与对照组比较，茶多酚干预后皮质前体OLG有不同程度的减少，未成熟OLG及成熟OLG则有不同程度的增加，差异有统计学意义(25 mg/kg、100 mg/kg,均P< 0.05;50 mg/kg,P< 0.01)。结论茶多酚对OLG缺血性反应有保护作用，并呈现剂量依赖性。 【关键词】 少突胶质细胞;茶多酚;全脑缺血 Effects of tea polyphenol on oligodendrocyte in cerebral ischemic rats CHEN Yingzhu, TIAN Ye, ZHANG Zhilin, et al. Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, China Abstract：Objective To investigate the effects of tea polyphenol on oligodendrocyte(OLG) in the cerebralischemic rats. Methods Male Sprague Dawley rats were randomly divided into shamoperated group, control group and tea polyphenol group. The models of wholebrain ischemia were established . Then the rats of tea polyphenol group were divided another 3 groups and injected intraperitoneally with tea polyphenol at diffenrent dose (25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, respectively) once a day for seven days . The expressions of precursor OLG cells, pedoOLG cells and mature OLG cells in the cortex were examined by immunohistochemistry and the positive cells were counted.Results Compared with shamoperated group, the number of precursor OLG cells increased and the number of pedoOLG cells and mature OLG cells decreased significantly in the control group (all P<0.05). Compared with control group, the number of precursor OLG cells decreased significantly after tea polyphenol treatment, while the number pedoOLG cells and mature OLG cells increased significantly(25 mg/kg, 100 mg/kg ,allP<0.05; 50 mg/kg， P<0.01). Conclusion Tea polyphenol played a protective role in OLG ischemic reaction at a dose dependent manner. Key words：oligodendrocyte;tea polyphenol;global cerebral ischemia 许多临床缺血缺氧事件中少突胶质细胞(OLG)有选择易损性［1］。氧化应激和兴奋毒性损伤是导致缺血性卒中急性期OLG快速死亡的重要原因［2］。本研究通过对脑缺血动物模型给予绿茶提取物茶多酚干预，观察其对OLG的影响，为茶多酚应用于临床预防和治疗脑缺血提供科学的实验依据。1 材料与方法 1.1 动物及分组 健康雄性SD大鼠40只，由苏州大学医学院实验动物中心提供，质量200～240 g。随机分为茶多酚组、对照组及假手术组，其中茶多酚组根据给药剂量再分为茶多酚25 mg/kg组、50 mg/kg组、100 mg/kg组；每组8只。 1.2 方法 1.2.1 动物模型制备 采用Pulsinelli法［3］建立大鼠四血管闭塞急性全脑缺血模型。20%乌拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉，项部正中纵向切口，暴露第一颈椎翼小孔，用双极电凝器永久性凝闭双侧椎动脉；翌日麻醉后颈正中纵向切口，暴露双侧颈总动脉并夹闭20 min，然后松夹实现再灌注。假手术组只暴露翼小孔和双侧颈总动脉，不作电凝和夹闭。模型成功的标志为动物翻正反射消失，眼变白，呼吸加快，竖毛，或1 min后无反应但睫毛反射存在。 1.2.2 药物干预方法 茶多酚组大鼠制模后即刻分别按剂量25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg茶多酚腹腔注射，每日1次，连续7 d；对照组将等量生理盐水腹腔注射；假手术组不予处理。 1.2.3 标本制作及染色 术后第7 d各组大鼠麻醉后用4%多聚甲醛经左心室常规灌注固定后断头取脑，由前向后做冠状切片，取包括质、海马及胼胝体的脑组织块置10%中性福尔马林固定，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明1 h、62℃浸蜡3 h后石蜡包埋、切片(片厚5 μm)，常规脱蜡和水化、0.1%苏木素浸染3～10 min、1%盐酸乙醇分化3～5 s、碳酸锂饱和水溶液1～2 min、0.5%伊红溶液浸染1～2 min、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，光镜观察。 1.2.4 免疫组化染色 采用SP法。石蜡切片经脱蜡处理后入水；0.3%H2O2室温反应10 min；10%羊血清室温封闭10 min；小鼠抗大鼠一抗A2B5(1∶100，用于标记前体OLG)、O4 (1∶100，用于标记未成熟OLG)、CNPase(1∶100，用于标记成熟OLG) 4℃过夜；生物素化二抗37℃反应15 min；辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素37℃反应15 min；DAB显色5～10 min；苏木素复染2 min；水洗后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。 1.2.5 统计学方法 实验数据以均数±标准差(±s)表示，应用SPSS 11.5统计软件对所得资料进行分析。组间比较采用F分析，进行StudentNewmanKeuls检验。2 结果 2.1 组织学改变 光镜下，假手术组皮质神经元排列规则，胞核及核仁明显，胶质细胞形态正常、数量较多；对照组皮质神经元变形、缺失，胶质细胞肿胀、反应性增生；茶多酚组皮质胶质细胞形态趋于正常，但数量增多。见图1。 2.2 各组OLG谱系变化的比较 见图2及表1。假手术组大鼠脑皮质分布有一定数目的A2B5、O4、CNPase阳性细胞；与假手术组比较，对照组皮质A2B5阳性细胞数增多，O4、CNPase阳性细胞数减少，差异有统计学意义(均P<0.05)。与对照组比较，各茶多酚组皮质A2B5阳性细胞数均明显减少(P<0.05～0.01)；O4、CNPase阳性细胞数有不同程度的增加，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)。 图1 各组大鼠脑皮质HE染色(×200) （略） A:假手术组神经元排列规则, 胞核及核仁明显, 胶质细胞形态正常, 数量较多;B:对照组神经元变形、缺失, 胶质细胞深染, 数量增多, 间质水肿;C:茶多酚（50 mg/kg）组神经元、胶质细胞形态趋于正常, 胶质细胞数量增多 图2 各组大鼠脑皮质免疫组化染色(×200)（略） A：假手术组较多CNPase阳性细胞, 突起较多、排列整齐;B：对照组CNPase阳性细胞较少, 突起较少, 排列欠整齐;C：茶多酚（50 mg/kg）组见较多CNPase阳性细胞, 突起较多；D：假手术组见较多O4阳性细胞, 胞浆和突起着色较深;E：对照组O4阳性细胞较少, 胞浆和突起着色较浅;F：茶多酚（50 mg/kg）组见较多O4阳性细胞, 着色较深；G：假手术组见较多A2B5阳性细胞, 胞浆和胞膜着色较浅;H：对照组A2B5阳性细胞增多,着色较深;I：茶多酚（50 mg/kg）组见较多A2B5阳性细胞, 着色较深 表1 各组OLG谱系细胞数变化的比较（略） 注：与假手术组比较*P<0.05,**P<0.01;与对照组比较▲P<0.05,▲▲P<0.013 讨论 OLG是中枢神经系统的成髓鞘胶质细胞，与神经元一样，对缺血性损伤有高度敏感性，其损伤机制包括氧化应激、兴奋性氨基酸和凋亡通路激活等［4］。本实验采用A2B5、O4、CNPase分别标记OLG谱系的前体OLG、未成熟OLG和成熟OLG，观察缺血条件下大鼠脑内皮质OLG变化特征，以及茶多酚对其的影响。结果显示，脑缺血导致皮质O4阳性表达的未成熟OLG和CNPase阳性表达的成熟OLG数量减少，提示缺血缺氧除造成神经元损伤外，也导致严重的OLG损伤，此与其他缺血缺氧性脑损伤模型研究结果相一致［5］。成熟OLG减少可能是未成熟OLG脱失的结果，也可能是前体OLG、未成熟OLG分化延迟或功能异常所致。实验还发现，脑缺血后成熟OLG减少的同时伴有前体OLG反应性增加，说明缺血早期OLG的数量减少常伴有随后前体OLG的激活以及OLG的逐渐恢复，提示前体OLG激活有助于OLG的补充。 由于脑损伤的病理生理改变存在诸多环节，如氧自由基、Ca2+超载、兴奋性氨基酸毒性作用和生物膜损伤等，只要针对其中某一环节施加干预都将打断级联反应，保护神经细胞。中药作用的多重性与缺血性脑卒中的病理生理反应多样性相对应。茶多酚是从绿茶叶中分离提取的多酚类化合物，化学结构中的酸性酚羟基具有很强的供氢能力和显著的清除氧自由基能力，是目前报道的抗氧化作用最强的药物之一［6］。茶多酚不仅可剂量依赖性地减轻沙土鼠一过性全脑缺血模型中海马CA1区神经元缺血性死亡［7］，还可改善脑缺血后的学习记忆损害［8］；此外茶多酚可提高谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，有利于氧自由基清除［9］，对缺血性损伤有保护作用。本实验用不同剂量的茶多酚对脑缺血模型大鼠腹腔注射，观察大鼠脑内OLG数量变化。结果显示，3种剂量茶多酚均可不同程度地增加缺血皮质未成熟和成熟OLG数量、减少前体OLG反应性增加，其中50 mg/kg作用为甚。提示茶多酚能减轻OLG缺血缺氧性损伤；在HE染色中可见皮质神经元变形、缺失，胶质细胞肿胀、反应性增生有不同程度的减轻，提示茶多酚有神经保护作用，并呈剂量依赖性。由于缺血缺氧性脑损伤除了氧自由基损伤和脂质过氧化外还涉及其他因素，加上缺血性神经元损伤的发病机制不完全适用于OLG。尽管茶多酚已被证实有神经保护作用，但其保护OLG缺血性损伤的确切机制仍需深入研究。【参考文献】 ［1］Liu YQ, Silverstein FS, Skoff R, et al. HypoxicIschemic oligodendroglial injury in neonatal rat brain［J］. Pediatric Res,2002,51:25. ［2］Back SA, Han BH, Luo NL, et al. Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to Hypoxia/ischemia［J］. J Neurosci,2002,22:455. ［3］Pulsinelli WA, Beierly JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat［J］. Stroke,1979,10:267. ［4］Dewar D, Underhill SM, Goldberg MP. Oligodendrocytes and ischemic brain injury［J］. J Cerebral Blood Flow & Metab,2003,23:263. ［5］Back SA, Han BH, Luo NL, et al. Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to Hypoxia/ischemia［J］. J Neurosci,2002,22:455. ［6］杨丽松, 周琴, 李卫平. 茶多酚静脉内给药对动物缺血性脑损伤的保护作用［J］. 大连医科大学学报,2004,26:170. ［7］Matsuoka Y, Hasegawa H, Okuda S, et a1. Ameliorative efects of tea catechins active oxygenrelated nerve cell injuries［J］. J Pharmacol Exp Ther,1995,274:602. ［8］何冰, 陈小夏, 陈一岳. 茶多酚对脑缺血再灌注损伤的保护作用及在体外抗脂质过氧化和清除自由基作用［J］.中国药理学报, 2002,11:157. ［9］Lee S, Suh S, Kim S. Protective efects of the green tea polyphenol(-)epigallocatechin gallate against hippocampal neuronal damage after transient global ischemia in gerbils［J］. Neurosci Lett,2000,287:191.
