超顺磁性氧化铁标记神经干细胞移植入局灶性脑缺血大鼠纹状体的MRI示踪及其对学习记忆的影响

超顺磁性氧化铁标记神经干细胞移植入局灶性脑缺血大鼠纹状体的MRI示踪及其对学习记忆的影响作者：晋光荣，徐汉荣，居胜红，韩群颖，张海军，刘俊华，沈志花    作者单位：210009南京，东南大学基础医学院神经科学研究所（晋光荣，张海军，刘俊华，沈志花）；盐城市第一医院神经内科（徐汉荣）；东南大学附属中大医院放射科（居胜红）；南京医科大学基础医学院解剖教研室（韩群颖）    【摘要】  目的 探讨以超顺磁性氧化铁（SPIO）标记的胎鼠神经干细胞（NSCs）移植入局灶性脑缺血大鼠纹状体的MRI示踪及其对学习与记忆的影响。方法 体外培养的胎鼠NSCs用Fe2O3多聚左旋赖氨酸（Fe2O3PLL）标记，普鲁士蓝和台盼蓝染色分别检测标记率和细胞活力。将大鼠随机分为A组（正常对照组）、B组（正常标记NSCs移植组）、C组（脑缺血组）、D组（标记NSCs移植组）、E组（未标记NSCs移植组）及F组（灭活标记NSCs移植组）。取C组、D组、E组和F组大鼠制备局灶性脑缺血模型；将标记及未标记的NSCs悬液及灭活的标记NSCs悬液分别定向注射于B组、D组、E组和F组大鼠左侧纹状体内；移植后3 d、7 d、2周、3周、4周，对A组、C组、D组和E组分别进行Y型电迷宫检测；对B组、D组和F组进行活体MRI示踪扫描；MRI扫描后的大鼠行脑组织切片普鲁士蓝染色，观察移植的NSCs分布。结果 NSCs的Fe2O3PLL标记率近100%，标记的NSCs细胞活力为95%。与C组比较，D组和E组移植后各时间点大鼠的学习与记忆能力明显改善（均P<0.05）；MRI显示移植4周后D组移植区低信号影范围较大；脑组织切片可见移植的NSCs沿胼胝体向对侧迁移。结论 Fe2O3PLL标记不影响NSCs活力；移植NSCs能改善脑缺血大鼠的学习与记忆功能；移植的NSCs可向病灶区迁移。    【关键词】  神经干细胞；超顺磁性氧化铁；磁共振成像；局灶性脑缺血；移植　　Magnetic resonance imaging tracking of SPIOlabeled embryonic neural stem cells transplantation into corpus striatum of the focal cerebral ischemia rats and the effects of learning and memory abilities 　　JIN Guangrong, XU Hanrong, JU Shenghong，et al.  Institute of  Neurobiology,School of  Basic Medical Science, Southeast University, Nanjing 210009,China    Abstract：Objective  To explore the magnetic resonance imging tracking of superparamagnetic iron oxid(SPIO) labeled embryonic neural stem cells (NSCs) transplantation into corpus striatum of the focal cerebral ischemia(FCI) rats and the effects of learning and memory abilities.Methods  NSCs of embryonic rat were cultured in vitro and labeled with Fe2O3-mediated by poly-L lysine (PLL), with Prussian blue staining to evaluate the labeling rate and Trypan blue staining to observe cell viability of NSCs. The rats were randomly divided into groups A （normal control），B （normal labeled NSCs implanted），C （cerebral ischemia），D（ labeled NSCs implanted），E （unlabeled NSCs implanted）and  F (inactivated labeled NSCs implanted)．The FCI models were made in groups C, D, E, F．The labeled NSCs or unlabeled NSCs or inactivated labeled NSCs were stereotaxically injected into the left corpus striatum of groups B,D,E,F respectively. The abilities of learning and memory were measured by the Y-type electronical maze in groups A, C, D, E after 3 d,7 d,2,3,4 weeks of transplantation respectively. MRI scanning was performed to monitor the NSCs in groups B, D, F at corresponding time. After MRI, the rats were killed and undergone Prussian blue staining of the brain histological section to observe the distribution of implanted NSCs.Results  The labeling efficiency rate and cell viability of Fe2O3-PLL labeled NSCs were almost 100% and 95% respectively. Compared with group C, the abilities of learning and memory were significantly improved at each time point after transplantation in groups D, E (all P<0.05).The expanded  low signal intensity could be observed at implanted areas by MRI in group D. Prussian blue staining demonstrated the labeled NSCs migrating into opposite side along corpus callosum.Conclusions  The viabilities of  labeled and unlabeled Fe2O3-PLL NSCs are almost same. The abilities of learning and memory can be improved after transplanted NSCs to FCI rat,and the transplanted NSCs can move to ischemia area.    Key words：neural stem cells; superparamagnetic iron oxid; magnetic resonance imaging; focal cerebral ischemia; transplantation 　　移植由新型的MRI特异性示踪剂——超顺磁性氧化铁（SPIO）类标记移植的神经干细胞（NSCs），能通过MRI对其在宿主体内迁移、分布和生存情况实时监测［１，２］。本研究用自行制备的SPIO纳米粒子Fe2O3多聚左旋赖氨酸（PLL）［3］标记胎鼠皮质NSCs，移植入局灶性脑缺血大鼠的纹状体，应用MRI仪对脑内移植的NSCs活体示踪，并结合Y型电迷宫验证NSCs移植后对脑缺血模型鼠学习与记忆的影响。1  材料与方法　　1.1  材料　　1.1.1  动物与分组  健康孕14.5 d的SD大鼠1只，质量350 g；清洁级3月龄雄性SD大鼠36只，质量250～280 g，由东南大学动物中心提供。常规环境下饲养，光暗周期12 h。随机分为6组，A组：正常对照组；B组：正常标记NSCs移植组；C组：脑缺血组；D组：标记NSCs移植组；E组：未标记NSCs移植组；F组：灭活标记NSCs移植组；每组6只。　　1.1.2  试剂和仪器  DMEM/F12培养基、B27无血清培养添加剂、表皮生长因子（EGF）、成纤维生长因子（bFGF）（美国Invitrogen公司）；10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；Fe2O3PLL悬浮液(20 mg/ml,东南大学生物医学工程系提供）；CO2培养箱（日本SANYO公司），倒置显微镜（Olympus）；江湾Ⅰ型C立体定向仪（上海第二军医大学）；Leica冰冻切片机（德国Leica公司）；1.5T MRI仪（Philip公司，Eclipse机型）；Y型电迷宫仪（张家港生物医学仪器厂）。　　1.2  方法　　1.2.1  胎鼠皮质NSCs的分离、培养与鉴定  麻醉后采用颈椎脱臼法处死孕14.5 d的SD大鼠，无菌条件下取出胎鼠，分离大脑皮质，去除脑膜和血管，剪碎脑组织，0.125%胰蛋白酶消化，吸管吹打制成细胞悬液，离心、吸去上清，过滤后接种于含20 ng/ml EGF、bFGF和2% B27的DMEM/F12培养液中，将培养瓶置入37℃、5%CO2培养箱中，常规换液，倒置显微镜观察细胞生长形成原代神经球，进行反复传代，并用Nestin免疫荧光细胞化学法鉴定NSCs。　　1.2.2  NSCs的标记、灭活、活力测定及普鲁士蓝染色  将Fe2O3PLL(铁终浓度25 μg/ml)加入上述细胞悬液和无血清培养液中，置于37℃、5% CO2培养箱内孵育2 d。将NSCs球制成单细胞悬液，离心去上清，反复冲洗去掉游离的Fe2O3PLL；吸取部分标记NSCs的悬液置离心管，在沸水中2 h灭活后，冷却待用；将标记、未标记及灭活标记NSCs单细胞悬液（106个/ml）各0.9 ml分别置于试管中，加入0.1 ml的0.4%台盼蓝溶液，混匀静置3 min，光镜下见死亡的NSCs被蓝染，存活的NSCs拒染，血球计数板计数活细胞百分率；将标记的NSCs涂布于玻片上，用4%多聚甲醛固定30 min，双蒸水洗涤3次，2%亚铁氰化钾及6%盐酸水混合液孵育30 min，双蒸水洗涤3次，1%核固红复染3 min，高倍镜下，胞浆有蓝色颗粒为普鲁士蓝阳性细胞，即为NSCs。　　1.2.3  动物模型制作  将C组、D组、E组、F组的大鼠麻醉后参照Zea longa［4］线栓法栓塞右侧大脑中动脉，制成局灶性脑缺血再灌注模型。大鼠清醒后观察其行为学改变，按Zea longa 5级评分标准［5］评定神经系统体征，1～3级确定为成功模型。　　1.2.4  NSCs脑内定向移植  将脑缺血再灌注7 d后的D组、E组、F组的大鼠及B组大鼠，麻醉后固定于立体定位仪上，切开头皮暴露颅骨，按纹状体定位坐标钻孔（冠矢点0 mm，向左侧3.0 mm，深度5.0 mm），抽取标记的NSCs悬液注射于B组和D组、未标记NSCs悬液注射于E组、灭活标记NSCs悬液注射于F组大鼠的左侧纹状体内，均为30 μl（NSCs为2×105 个/μl），15 min内缓慢匀速注入，留针20 min，拔针后用明胶海棉封孔。　　1.2.5  学习与记忆能力的检测  D组和E组于移植后3 d、7 d、2周、3周、4周，C组于与D组相对应时间点以及A组大鼠分别进行Y型电迷宫检测［6］，以N表示达到学会标准的训练次数、A/10表示记忆保持率作为其空间分辨反应的学习记忆成绩。　　1.2.6  MRI示踪  将B组、D组、F组大鼠按移植后3 d、7 d、2周、3周、4周进行MRI扫描。选取快速自旋回波序列T2WI和梯度回波序列 T2*WI，表面线圈为内径12.7 cm，冠状面扫描：Fov 60 mm×60 mm，激励次数2；层厚2.5 mm；矩阵256×256；扫描范围覆盖两侧大脑半球。　　1.2.7  脑组织切片制备及普鲁士蓝染色  经MRI扫描后的B组、D组、F组大鼠随机各取2只，麻醉后开胸，经左心室灌入4%多聚甲醛溶液固定，断头取脑。切取针道前后各3 mm的脑组织块，冰冻后冠状切片，片厚40 μm。脑片用0.1 mol/L PBS和双蒸水各洗涤3次，行普鲁士蓝染色。光镜下随机选取3个视野，观察胞浆有蓝色颗粒为普鲁士蓝阳性NSCs。　　1.2.8  统计学方法  数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 11.5统计软件，组间比较应用F分析。2  结果　　2.1  NSCs体外增殖  原代细胞在无血清培养液中悬浮生长，多数细胞在48 h内聚集形成悬浮生长的细胞团，呈形态规则的球形，折光性强，未见明显的细胞突起，2周后显微镜下可见大小不等且不规则的神经球贴壁生长，并有部分细胞向外迁移。间接免疫荧光细胞化学法显示，亚代克隆细胞球Nestin抗原多为阳性，经单细胞克隆形成新的悬浮生长的神经球。　　2.2  NSCs的Fe2O3PLL标记率  经传6代的NSCs球加入Fe2O3PLL标记后，继续扩增，显微镜下可见NSCs球呈均匀黑褐色。经单细胞悬液后涂片行普鲁士蓝染色，光镜下观察见细胞浆内有蓝色颗粒的阳性细胞近100％。　　2.3  标记、未标记及灭活标记的NSCs活力的检测结果  经Fe2O3PLL标记NSCs活力为95％；未标记NSCs活力为98％；两者间差异无统计学意义。灭活标记NSCs的活力为0。　　2.4  各组大鼠造模结果  C组、D组、E组及F组的24只大鼠均造模成功，清醒后均出现神情萎靡，不思饮食，左侧肢体偏瘫和向左侧旋转追尾，行走困难等神经功能缺失的表现。　　2.5  各组大鼠水迷宫测试成绩的比较  见表1。与A组比较，C组各时间点的学习记忆能力明显降低（均P<0.05）；而D组和E组学习和记忆能力随时间延长而逐渐恢复，各时间点较C组有显著性改善（均P<0.05），移植3周时恢复到正常水平。　　表1  移植前后各组大鼠学习与记忆能力的比较（略）　　注：与A组比较*P<0.05；与C组比较△P<0.05　　2.6  MRI示踪结果  D组和F组大鼠于移植后3 d、7 d、2周时，在T2*WI见右侧缺血区呈明显高密度影，左侧移植区可见清晰的类圆形低信号影（图1～3）。移植后4～6周，D组低信号影范围较大，并靠近皮质下胼胝体，尖端向缺血侧延伸（图2）。B组和F组低信号影较小，色淡，边缘模糊（图3、4）。　　图1  D组移植后1周，右侧缺血区呈明显高密度影，左侧移植区见清晰的类圆形低信号影（略） 　　图2  D组移植后4周，低信号影范围较大，并靠近皮质下胼胝体，尖端向缺血侧延伸（略） 　　图3、图4  F组及B组移植后 2周，均可见低信号影较小、变淡，边缘模糊（略）　　注:图1～4  实心箭头所示脑缺血区的高密度影，空心箭头所示NSCs移植区低信号影　　2.7  移植的NSCs分布情况  见图5、6。D组脑组织切片可见移植点周围有大量普鲁士蓝阳性细胞，并从移植点沿胼胝体向缺血侧迁移，形成一个尖端指向缺血侧的“迁移流”(图5)。最远的阳性细胞距移植中心有2 mm。B组脑组织切片可见移植针道及周围有普鲁士蓝阳性细胞，无明显迁移(图6)。F组脑组织切片未见普鲁士蓝阳性细胞。　　图5  D组脑组织切片，箭头所示普鲁士蓝阳性细胞沿胼胝体的迁移流(普鲁士蓝染色 ×200，cc为胼胝体，Fr为额叶皮质，CPu为尾壳核) （略）　　图6  B组脑组织切片，箭头所示针道及周围普鲁士蓝阳性细胞无明显迁移（普鲁士蓝染色 ×200）（略）3  讨论　　在NSCs移植的实验研究和临床应用中，多采用标记NSCs的方法来区别供体NSCs和宿主细胞。分子影像学的研究方法能可视、动态地观察活体NSCs的移植部位、存活及迁移路径与功能变化。Fe2O3PLL是由带正电荷的转染剂PLL包裹氧化铁纳米粒子制作而成，具备粒径小、穿透性强、易被带负电荷的培养细胞所摄取的特点。本研究采用低浓度(25 μg/μl )Fe2O3PLL标记NSCs，经普鲁士蓝染色显示其标记率近100%；用台盼蓝拒染法比较标记NSCs与未标记NSCs的存活率差异无统计学意义。证明了用Fe2O3PLL标记NSCs的活力及增殖不受影响。由于SPIO类示踪剂的生物可降解性好，能被细胞代谢后进入正常血浆铁池，对机体无毒副作用，是目前较理想的MRI示踪剂。　　本研究用Fe2O3PLL标记NSCs移植到脑缺血对侧纹状体，通过MRI示踪证实移植的NSCs有向缺血区迁移的趋向；通过比较移植灭活标记NSCs及标记NSCs的扩散范围和迁移方向，表明MRI示踪能很好地评价标记NSCs移植后的活力。另外，移植标记的NSCs于脑缺血对侧，避免MRI上脑缺血区的高密度影会影响到标记NSCs低信号影的成像示踪，不致影响辨认移植NSCs的分布范围和迁移。　　NSCs的迁移机制十分复杂，NSCs的迁移是脑缺血后两侧半球的脑内微环境发生变化，大量的神经生长因子、营养因子和脑缺血区的炎性因子和细胞因子等形成了NSCs向缺血区迁移的趋化因素［2，8，9］，有利于在体NSCs生发区（如脑室下区、皮质、尾壳核等［10-12］）以及通过不同途径移植（如静脉内、脑室内或脑实质内移植）的NSCs向缺血区迁移。本研究MRI示踪并通过脑片普鲁士蓝染色发现，阳性标记NSCs沿着胼胝体或其下方向缺血区呈线状聚集的现象，证实其向缺血区迁移。另外，本研究对正常大鼠移植标记NSCs的MRI示踪未见到迁移现象，推断正常脑内可能缺乏因脑损伤产生的炎性因子和细胞因子等迁移趋向因素，支持NSCs迁移机制的理论。　　为了验证MRI活体示踪标记NSCs的迁移与移植有效性，本研究用Y型电迷宫对移植后的大鼠进行学习与记忆检测，结果无论是移植标记或非标记NSCs，均改善移植组大鼠的学习与记忆能力，表明移植NSCs能促进脑缺血大鼠的认知功能的恢复。    本研究证明MRI示踪标记Fe2O3PLL的NSCs，移植到局灶性脑缺血大鼠脑内的迁移和分布是可行的。NSCs移植能改善局灶性脑缺血大鼠的学习记忆能力，证明了NSCs脑内移植对脑缺血的治疗是有效的，为进一步的实验研究和临床应用提供了依据。【参考文献】　　［1］Arbab AS, Bashaw LA, Miller BR, et al.Intracytoplasmic tagging of cells with 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