载脂蛋白B基因EcoRⅠ和MspⅠ多态性与颈动脉粥样硬化的关系

作者：白永生，周丽萍，白向东，杜秦川   

作者单位：1.宁夏回族自治区人民医院神经内科，银川 750021；2.宁夏医学院附属医院中医科，银川 750004；3.银川市第一人民医院神经内科，银川 750001

【摘要】  目的 探讨载脂蛋白B(apoB)基因EcoRI和MspI位点多态性与颈As、血脂代谢的关系。方法 用二维超声测量97例颈As患者和68例健康者IMT及PI，PCR-RFLP技术检测apoB基因EcoRI、MspI多态性。结果 (1)颈As组和对照组R-等位基因频率比较差异无统计学意义，但R-R-/R+R-基因型TG、TC、LDL-C、apoB显著高于R+R+基因型；(2)颈As组和对照组M- 等位基因频率比较差异无统计学意义，M-M-/M+M-和M+M+基因型间TG、TC、LDL-C、HDL-C、apoB、apoAI等比较差异无统计学意义。结论 (1)ApoB基因EcoRI位点多态性与血脂代谢有明显关系，与颈As程度关系不明显。(2)ApoB基因MspI位点多态性与血脂代谢和颈As程度无明显关系。

【关键词】  颈动脉粥样硬化；多态性；载脂蛋白B；基因

　　Study on the Relationship Between Carotid Atherosclerosis Diseases and EcoRⅠ& MspⅠ Polymorphisms of Apolipoprotein B Gene

　　Dept. of Neurology, the People’s Hospital of Ningxia, Yinchuan 750021

　　Abstract: Objectives  To investigate the association between EcoRⅠ& MspⅠ polymorphisms of apolipoprotein B gene and carotid atherosclerosis, serum lipid, apolipoprotein. Methods  Carotid intima-media thickness and the plaque index of 165 subjects were detected by 2-dimensional ultrasound, and the polymerase chain reaction (PCR) and the restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis were used to tested the distribution of allele and genotype frequencies of EcoRⅠand MspⅠpolymorphisms of apolipoprotein B gene. Results  The frequency of R- alleles was not significance different between atherosclerosis and control groups，but the heterozygous and homozygous carriers of R-R-/R+R- alleles displayed significantly higher concentration of TG, TC, LDL-C apoB and lower HDL-C than did subjects who were homozygous of R+R+ alleles. The frequency of M- alleles did not show significant difference between atherosclerosis group and control group. The levels of TG, TC, LDL-C, HDL-C, apoB in M-M-/M+M- gene type did not show significant difference from that of M+M+ gene type. Conclusions  The EcoRⅠpolymorphisms of apoB gene might affect serum lipid profiles. The MspⅠpolymorphisms in apoB gene didn’t show the potiential of affecting the plasma lipid profiles and atherosclerosis.

　　Key words: carotid atherosclerosis；polymorphisms；apoB；gene

    高频超声能检测颈动脉内-中膜厚度(IMT)和发现粥样斑块，诊断颈动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)。载脂蛋白B基因存在明显的多态性，且与冠心病、高脂血症等疾病有关，apoB基因变异与冠心病的关系受到国内外学者的广泛重视。本文应用PCR技术研究apoB基因EcoRⅠ和MspⅠ位点多态性在颈动脉As患者与对照组之间的差异，探讨其与颈As发病的关系。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究对象

　　选择无血缘关系研究对象165人，均为银川市居民，回族4例，其余均为汉族；颈As组97例，均为超声检查诊断为颈As的患者，男67例，女30例，平均年龄(51.8±7.7)岁；对照组68例，均为颈动脉超声检查正常者，经询问病史、查体、心电图、实验室检查排除冠心病、高血压、高血脂，男41例，女27例，平均年龄(53.4±7.7)岁。

  颈As诊断标准［1］：(1)至少一个动脉段的单个最大IMT(内-中膜厚度)≥1.0 mm或局部有斑块形成；(2)由IMT增厚、局部斑块引起颈动脉管腔狭窄；颈动脉斑块指数(plaque index，PI)评判标准：IMT＜1.0 mm为0级，IMT在1.0～2.0 mm之间或仅有一个斑块为1级；有1个斑块，其IMT在2.1～4.0mm之间，或有多个斑块为2级；多个斑块中如有1个IMT＞4.1 mm为3级。斑块指数为双侧颈动脉斑块指数的总和。

　　1.2  仪器和试剂

　　西门子VERSA彩色多普勒超声仪，7.5Hz线阵式探头；日立公司717BM全自动生化分析仪；BIO-RAD公司Icycler Thermal Cycler扩增仪；Gel Doc2000凝胶图像分析系统；华美生物工程公司Taq DNA聚合酶。

　　1.3  检测指标和方法

　　1.3.1  血脂分析

　　TG、TC采用氧化酶法测定，apoAI和apoB用免疫透射比浊法测定，HDL-C用酶法测定，LDL-C由Friedwald公式计算：LDL-C=CHO-HDL-TG/5。

　　1.3.2  模板DNA的提取

　　采集静脉血，用EDTA-K2抗凝，用酚-氯仿抽提法提取白细胞基因组DNA。

　　1.3.3  PCR扩增

　　参照文献［2-3］设计引物，扩增EcoRI多态性位点的引物，上游：5′-CTG AGA GAA GTG TCT TCA AAG-3′，下游：5′-CTG AGA GAA GTG TCT TCA AAG-3′；扩增MspI多态性位点的引物，上游：5′-TCT CGG GAA TAT TCA GGA ACT AAT G-3′，下游：5′-CTA AGG ATC CTA CAA TGT CAA GGT-3′。PCR总反应体系50μL，其中10×Buffer 5.0μL(Mg2+-free)，MgCl2溶液3.0μL(25mmol/L)，dNTP 1.0μL(100mmol/L)，P1、P2各1.0μL(25mmol/L)，模板DNA 1.0μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(5 U/μL)，dd-H2O 37.5μL。PCR反应条件：EcoRI多态性：94℃预变性4min；94℃变性60s，58.6℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环周期后72℃再延伸5min，4℃恒温保存。MspI多态性：94℃预变性4min；94℃变性60s，61.8℃退火45s，72℃延伸120s，35个循环周期后72℃再延伸5min，4℃恒温保存。溴化乙锭染色，2%琼脂糖胶电泳鉴定PCR产物。

　　1.3.4  PCR产物酶切

　　EcoRI酶切反应体系：PCR产物10.0μL，10×Buffer A 3.0μL，EcoRⅠ1.5μL(12U/μL)，dd-H2O 5.5μL；MspI酶切反应体系：PCR产物10.0μL，10×Buffer B 3.0μL，MspI 1.0μL(10 U/μL)，dd-H2O 6.0μL；37℃孵育4h后再65℃保温5min。反应终止后EB染色，3.5%(MspI用3%琼脂糖胶)琼脂糖胶电泳分离，用凝胶图像分析系统照相。

　　1.4  颈动脉彩色多普勒超声检查

　　从前、侧、后三个方向观察被检查者CCA、分叉部(BIF)和颈内动脉(ICA)颅外段等部位，测量IMT及斑块大小、位置、形态。避开有动脉粥样斑块的部位，测量BIF、BIF近心端和远心端等部位前后壁6个位点的心室舒张末期的IMT，双侧12个位点IMT的平均值作为IMT。

　　1.5  统计学方法

　　采用SPSS 11.5软件进行统计分析，计量资料以x±s表示；组间比较采用t检验；等位基因频率用基因计数法，等位基因频率=(2×纯合子＋杂合子)/(2×受检人数)；组间等位基因分布和基因型频率的差异比较用χ2检验。

　　2  结果

　　2．1  颈As组和对照组IMT、血脂水平比较

    颈As组IMT、TG、TC、HDL-C、LDL-C、apoAI与对照组比较差异有统计学意义，apoB两组间比较差异无统计学意义(见表1)。表1  颈As组和对照组IMT、血脂、载脂蛋白水平比较(略)

　　2.2  apoB基因EcoRI和MspI多态性检测

    PCR产物均为480 bp，其中EcoRI酶切后呈3种基因型：R-R-基因型呈1条带；R-R+基因型呈3条带；R+R+基因型呈2条带。MspI酶切后呈3种基因型：M-M-基因型呈1条带；M-M+基因型呈3条带；M+M+基因型呈2条带(见图1和表2)。

　　2.3  颈As组和对照组apoB基因EcoRI、MspI多态性基因频数分布和等位基因频率比较

两组人群EcoRI、MspI多态性基因频数分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有群体代表性，两组均以R+R+基因型为主，R+R-基因型次之，R-R-基因型少见；两组R+、R-等位基因频率分布虽有差异，但无统计学意义。颈As组和对照组均以M+M+基因型为主，M+M-基因型次之(仅颈As组发现1例M-M-基因型)；两组MspI多态性基因频数分布比较差异无统计学意义，P＞0.05(见表2)。表2  颈As组和对照组apoB基因EcoRI、MspI多态性基因频数分布和等位基因频率比较（略）

  EcoRI多态基因型分布比较P=0.52，等位基因频率比较P=0.435；MspI多态性基因型分布比较P=0.158，等位基因频率比较P=0.274

　　2．4  颈As组和对照组EcoRI多态基因型间血脂和载脂蛋白水平比较

    颈As组R-R-/R+R-基因型TG、TC、LDL-C、apoB水平显著高于R+R+基因型，R-R-/R+R-基因型HDL-C水平显著低于R+R+(P＜0.05)，而apoAI比较差异无统计学意义；对照组R-R-/R+R-和R+R+基因型间血脂、载脂蛋白比较差异无统计学意义(见表3)。表3  颈As组和对照组EcoRI不同基因型血脂和载脂蛋白水平比较(略)

　　2．5  颈As组和对照组MspI多态性基因型间血脂和载脂蛋白水平比较

    颈As组MspI多态性M-M-/M+M-基因型间血脂等比较差异无统计学意义，对照组MspI各基因型间血脂比较差异也无统计学意义(见表4)。表4  颈As组和对照组MspI不同基因型血脂和载脂蛋白水平比较(略)

　　2．6  颈As组EcoRI和MspI不同基因型IMT、PI分布比较

    R-R-/R+R-基因型IMT较R+R+基因型有增厚，但差异无统计学意义；M-M-/M+M-与M+M+基因型IMT比较无明显差异；EcoRI和MspI多态基因型间不同级别PI分布比较差异无统计学意义(见表5)。表5  EcoRI和MspI不同多态性基因型IMT(x±s)、PI比较（略）

　　3讨论

    apoB基因由43000 bp碱基组成，位于2号染色体短臂上，由28个内含子和29个外显子组成。apoB100是其全基因序列的转录产物；apoB的生理作用为参与VLDL的合成、装配和分泌；apoB100也是IDL和LDL的主要结构蛋白，参与脂质转运。80%LDL经细胞膜LDL受体途径清除，apoB100是介导LDL与相应受体结合必不可少的配体。apoB基因多态性影响血浆中apoB和LDL水平，apoB与颈As、缺血性脑卒中有密切关系［4］。本研究结果显示，颈As组IMT较对照组明显增厚，颈As组血清TC、LDL-C水平较对照组明显升高，HDL-C水平明显降低，表明apoB、LDL-C升高与颈As的发生有关。

    本研究发现颈As组R+、R-等位基因频率分别为0.902和0.098，对照组R+、R-等位基因频率为0.9338和0.0662，两组间比较差异无统计学意义。但颈As组R-R-/R+R-基因型TG、TC、LDL-C、apoB水平显著高于R+R+基因型，R-R-/R+R-基因型HDL-C水平显著低于R+R+基因型；对照组R-R+/-和R+R+两基因型间TG、TC、LDL-C、apoB有轻度增高趋势，HDL-C、apoAI水平稍有降低趋势，但两基因型间差异无统计学意义。颈As组R-R+/-基因型IMT较R+R+基因型有增厚趋势(1.19±0.113mm vs 1.12±0.107mm)，但无统计学意义；颈As组R+R+基因型颈动脉1、2、3级斑块指数(PI)人数分布和R-R-/R+R-基因型1、2、3级PI人数分布比较无统计学意义。研究报道［5］，apoB基因EcoRI多态性与血脂水平升高有关系，正常人R-等位基因携带者血浆TG、LDL-C呈较高水平，并在冠心病人群中比例较高。本研究发现R-R-/R+R-基因携带者TG、LDL-C显著高于R+R+基因携带者，HDL-C显著低于R+R+基因型，本研究结果与上述研究报道一致。本研究结果说明R-等位基因对血脂代谢有明显影响，但R-等位基因与颈As程度的关系不明显。EcoRI酶切位点消失可引起apoB、LDL-C水平升高［6］，所以apoB基因29号外显子EcoRI 酶切位点消失是颈As发生的危险因素。

 本研究发现颈As组暴露于突变M-等位基因的频率为6.19%。对照组M-等位基因的频率为2.21%，两组间M-等位基因频率和多态性基因型分布比较均无统计学意义。Verduci［7］等对82名严格饮食控制治疗的苯丙酮尿症患儿研究发现，MspI位点多态性对严格饮食控制治疗的苯丙酮尿症患儿的血脂无显著性影响。本研究发现颈As组和对照组中apoB基因26号外显子MspI多态性M+M+与M-M-/M+M-基因型间TC、TG、LDL-C、apoAI、apoB、HDL-C水平比较无统计学意义，本研究结果与上述研究报道一致。颈As组M-M-/M+M-与M+M+基因型间IMT比较、M-M-/M+M-和M+M+基因型间颈动脉不同级别PI人数分布比较差异均无统计学意义。MspI 酶切位点消失与颈动脉IMT无明显关系［8］。本研究结果表明，M-等位基因与血脂代谢和颈As程度无明显关系，M-等位基因不增加患颈As的危险。说明MspI位点多态性对基础血脂水平影响不明显，所以apoB基因MspI位点多态性与颈As无明显关系。

    总之，apoB基因EcoRI位点多态性对血脂代谢有明显的影响，虽与颈As程度无明显关系，但仍是颈As危险因素。MspI位点多态性与血脂代谢无明显关系，与颈As的程度也无明显关系，所以MspI位点多态性可能不是颈As的危险因素。

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　　［3］Soria LF，Ludwig EH，Clarke HR，et al.Association between a specific apolipoprotein B mutation and familial defective apolipoprotein B100［J］. Pro Natl Acad Sci U S A，1989，86(2)：587-591.

　　［4］Marianne B.Polymorphisms in Apolipoprotein B and Risk of Ischemic Stroke［J］. Clin Endocrinol Metab，2007，92(9)：3611 - 3617.

　　［5］Amanda JW，Barrett PH，Frank MB，et al.Lipid Disorders and Mutations in the APOB Gene［J］.Clin Chem，2004，50：1725 - 1732.

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　　［7］Verduci E，Agostoni C，Biondi ML，et al.Apolipoprotein B gene polimorphism and plasma lipid levels in phenylketonuric children［J］. Prostaglandins，Leukot Essent Fatty Acids，2004，71(2)：117-120.

　　［8］Seung HH，Ward R，Jeffrey R，et al.Lack of Association between Increased Carotid Intima-Media Thickening and Decreased HDL-Cholesterol in a Family with a Novel ABCA1 Variant，G2265T［J］. Clinical Chemistry，2002，48(11)：2066-2070.