家族性肌萎缩侧索硬化症研究中pGBKT7-mSOD1cDNA酵母双杂交表达载体的构建

作者：陈桂生   

作者单位：第三军医大学西南医院神经内科，重庆 400038

【摘要】  目的 构建能在酵母菌AH109中表达的mSOD1cDNA的穿梭表达质粒pGBKT7-mSOD1cDNA,研究突变SOD1编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用。方法 通过PCR法以真核表达载pEGFP-mSOD1cDNA为模板，扩增获得了120bp的mSOD1基因的末端及DNA结合域的片段，经过SalⅠ、EcoRⅠ双酶切后，基因重组的方法定向亚克隆于酵母双杂交载体pGBKT7中，构建形成pGBKT7-mSOD1真核表达载体。结果 经转化，提取质粒双酶切，核苷酸测序，BALST比对鉴定表明构建成功。结论 成功构建穿梭质粒pGBKT7-mSOD1cDNA，为深入研究突变的SOD1基因编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用奠定了基础。

【关键词】  酵母双杂交 载体 亚克隆 mSOD1cDNA pGBKT7

　　Construction of pGBKT7mSOD1 Yeast TwoHybrid Expression Vector　in Study of Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis

　　(Acta Aademiae Medicinae Militaris Fertiae,Chongqing 400083)

　　Abstract: Objective  To Construct of pGBKT7mSOD1 Yeast TwoHybrid Expression Vector in study of familial amyotrophic lateral sclerosis and to study Proteinprotein interactions of mutation SOD1 encode protein. Methods  We got the mSOD1 fragment from pEGFPmSOD1 by polymer case  reaction(PCR). After digestion by SalⅠand EcoRⅠ,mSOD1 fragment was subcoloned into Yeast TwoHybird  expression vector pGBKT7. Results  At last, pGBKT7mSOD1 Yeast TwoHybrid  expression vector was constructed and confirmed by Redigestion. Conclusion  The construction of pGBKT7mSOD1 is helpful to the studying of  Proteinprotein interactions.

　　Key words:Yeast TwoHybird; expression Vector; subclone; mSOD1CcDNA; pGBKT7

　　根据超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含金属的不同，可将其分为3种，分别为Cu,Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD，哺乳类动物体内，仅含有Cu,Zn-SOD与Mn-SOD。分布在胞浆中Cu,Zn-SOD，称为SOD1；分布于线粒体中Mn-SOD，称为SOD2；分布于胞外Cu,Zn-SOD称为SOD3,其中SOD1是细胞中高水平表达的SOD，是SOD的主要形式［1］。研究小组在对一个肌萎缩侧索硬化症家系致病基因的研究中发现［2］，SOD1第二号外显子出现突变，测序分析证实第2号外显子编码区插入了一个碱基A，第2外显子的插入突变导致SOD1转录和翻译时阅读框改变，结果SOD1翻译提前终止，研究小组把这108个碱基对的cDNA暂命名为mSOD1cDNA,提交GenBank，获得的编号是EF143990。本文报告载体pGBKT7-mSOD1cDNA构建，为研究mSOD1基因突变编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用奠定了基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  主要试剂：限制性内切酶SalⅠ、EcoRⅠ、Taq聚合酶购自大连Takara公司。DNA连接试剂盒购自美国MBI公司，卡那霉素购自上海华美公司，质粒抽提试剂盒购自美国Promega公司。

　　1.1.2  菌株和质粒：pGBKT7购自美国BD Clontech公司，pEGFP-mSOD1为本课题组提供，大肠杆菌DH5α为烧伤研究所提供。根据mSOD1cDNA的序列设计引物：pGBKT7-mSOD1-EcoRIsense5'-gacGAATTCATGGCGACGAAG-3',pGBKT7-mSOD1-SalIantisense:5'-gacGTCGACATGCTTCCCCACACCTTCATCT-3'，引物由上海生工生物科技有限公司合成。

　　1.1.3  仪器设备：台式离心机(上海安亭科仪厂生产)，PCR仪(美国Bio-Rad公司生产)，电泳仪(美国Bio-Rad公司生产)，手提紫外灯(美国Upland公司生产)，凝胶成像仪系统Gel Doc2000(美国Bio-Rad公司生产)

　1.2  方法

　　1.2.1  PCR反应：以pEGFP-mSOD1cDNA为模板，无核酸酶去离子水36.5μL，10×PCR　buffer (mg2+ free)5μL,dNTP(2.5mM)4 μL,Mgcl2(25mM)3 μL,上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL,模板1μL,Taq酶(5u/μL)0.5μL,总反应体系50μL。扩增条件：94℃预变性5min，紧跟30个循环，每一个循环94℃变性30s,55℃复性30s，72℃延伸30s,最后72℃延伸10min补齐末端。

　　1.2.2  PCR产物电泳及低熔点琼脂糖凝胶回收和纯化：取PCR反应物5 μL经0.8%琼脂糖凝胶电泳，结果扩增出一条约120bp的片段。取余下的PCR产物45 μL行1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化120bp的mSOD1cDNA片段，再次5 μL经0.8%琼脂糖凝胶电泳，并测序。

　　1.2.3  mSOD1酵母双杂交表达载体pGBKT7-mSOD1cDNA构建：分别以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切pGBKT7和mSOD1回收纯化酶切片段及线性化载体，在T4DNA连接酶的作用下连接，连接产物转化感受态细胞Ecoli.DH5α,将pGBKT7-mSOD1cDNA转化的细胞接种于卡那霉素选择培养基上，37℃培养12～16h，挑出阳性菌落摇菌，采用小质粒提取试剂盒提取质粒，以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定。

　　1.2.4  载体pGBKT7-mSOD1cDNA测序和BLAST比对。

　　2  结果

　　2.1  mSOD1cDNA片段的扩增  以含有mSOD1cDNA片段的真核表达载体pEGFP-mSOD1为模板，扩增mSOD1cDNA片段，长度120bp，如图1所示。图2为胶回收验证回收效果，从电泳图看胶回收效果满意。

　　2.2  mSOD1　PCR产物测序结果

　　2.2.1  mSOD1 PCR产物测序的序列结果：GAATTCatggcgacgaaggccgtgtgcgtgctgaagggcgacggcccagtgcagggcatcatcaatttcgagcagaaggaaagtaatggaccagatgaaggtgtggggaagcatGTCGAC

　　2.2.2  mSOD1 PCR产物测序的序列图：(图3，见封2)    　　测序图各峰整齐，无重叠，该PCR产物测序结果满意和可信。

　　2.3  mSOD1cDNA酵母双杂交载体的亚克隆  将经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切的mSOD1cDNA与线性化的pGBKT7连接，转化，提质粒，酶切结果如图4、5。将构建的载体命名为pGBKT7-mSOD1cDNA。

　　2.4  载体pGBKT7-mSOD1cDNA的测序和BLAST比对结果

　　2.4.1  载体pGBKT7-mSOD1cDNA的测序序列结果：CGAGCCGCCATCATGGAGGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAGGGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAGATGAAGGTGTGGGGAAGCATGTCGACCTGCAGCGGCCGCATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCGCGCTTGCAGCCAA

　　2.4.2  载体pGBKT7-mSOD1cDNA的测序结果图谱：(图6，见封2)

    把mSOD1cDNA构建到载体pGBKT7上，测序图峰值整齐，无重叠。

　　2.4.3  BLAST比对结果：

    经过BLAST比对mSOD1cDNA完全与pGBKT7相连。

　　3  讨论

    酵母双杂交技术是20世纪90年代兴起的一种研究蛋白质-蛋白质相互作用的高新分子生物学技术［3］，依据真核转录因子的DNA域和活性域分离的特性将两者分离，即将酵母的转录因子GAL4分为GAL4BD和GAL4AD。将拟研究的靶蛋自(prey)和钓饵蛋自(bait)分别与GAL4AD、GAL4BD结合形成融合蛋白，只有当靶蛋白与诱饵蛋白相互作用时，GAL4调控的报告基因才能表达，酵母才能在选择性培养基中生长。该技术不仅用于验证己知蛋白之间的相互作用,亦可以自酵母双杂交库中寻找与诱饵蛋白相结合的新的蛋白质，发现新基因。

    超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种金属酶，它可以使超氧阴离子O2-歧化为过氧化氢和分子氧，故在维持生物体内氧自由基的平衡方面起重要作用。研究表明,基于其细胞定位，认为SOD1主要参与防御外周质及来自外界环境中的超氧化物对机体的毒害［4-5］。

  肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种以脑和脊髓中大的运动神经元变性为特征的神经系统变性疾病，5%～10%的患者有家族性。临床表现为缓慢起病，进行性发展，逐渐出现四肢肌肉的无力、萎缩，伴锥体束征等。临床治疗非常困难。目前己肯定编码铜、锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide　dismutase，Cu/Zn SOD)的SOD1基因突变可引起部分家族性ALS的发病［6］。SOD1基因突变类型多达100种以上［7］。为了进一步研究该家系的发病机理，本文利用PCR技术和分子克隆方法，把mSOD1cDNA的序列亚克隆到酵母双杂交的表达载体pGBKT7中，目的是为下一步酵母双杂交打下基础，也是深入研究突变的SOD1编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用的关键步骤之一。

【参考文献】  　　［1］Faraci FM,Didion SP.Vascular protection superoxide dismutase is forms in the vessel wall［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004,24(1)：1367-1373.

　　［2］史树贵，李露撕，陈康宁，等.一个肌萎缩侧索硬化家系SOD1基因突变的发现［J］.中华医学遗传学杂志，2004,21(2)：149-152.

　　［3］Nakamura T,Hamada F,Ishidate T，et al. Axin,an inhibitor of the Wntsignalling pathway,interacts with beta-catenin,GSK-3beta and APC and reduces the beta-catenin level［J］.Genes Cells,1998,3(6):395.

　　［4］Narasipura SD,Auit JG,Behr MJ,et al.Characterization of Cu,Zn superoxide dismutase(SOD1) gene knock-out mutant of Crptococcus neogormans var.gattii:role in biology and virulence［J］.Mol Microbiol，2003,47(6):168-1694.

　　［5］Piddingto DL,Fang FC,Laessig T,et al.Cu,Zn superoxide dismutase of Mycobacterium tuberculosis contributes to survival in activated macrophages that are generation an oxidation burst［J］.Infect Immun，2001,69(8):4980-4987.

　　［6］Rosen DR,Siddique T，Patterson D,et al.Mutation in Cu/Zn superoxide dismutase gene ara associated with familial amyotrophic lateral sclerosis［J］.Nature，1993,362:59-62.

　　［7］Jacobson J,Jonsson PA,Andersen PM,et al.superoxide dismutase in CSF from amyotrophic lateral sclerosis patient with and without Cu/Zn superoxide dismutase mutations［J］.Brain，2001,124:1461-1466.