尼莫地平对急性损伤后大鼠背根节细胞cfos、cjun mRNA表达的影响

尼莫地平对急性损伤后大鼠背根节细胞cfos、cjun mRNA表达的影响作者：姚旭,丁新生,唐金荣,吴婷,德伟,袁栎    作者单位：210029南京医科大学第一附属医院神经内科［姚旭(现在马鞍山中心医院）,丁新生,唐金荣,吴婷］；南京医科大学生化教研室（德伟，袁栎）    【摘要】  目的 探讨钙离子拮抗剂尼莫地平对急性外周神经损伤后大鼠背根神经节cfos、cjun mRNA表达的影响。方法 建立大鼠坐骨神经切断模型，利用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）半定量法，检测经尼莫地平预处理的大鼠在制模后不同时间（5 min、15 min、30 min、60 min、120 min），以及同一时间（60 min）应用不同剂量(2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg)尼莫地平时大鼠背根神经节cfos、cjun mRNA的表达水平的变化。结果 与对照组比较，损伤组cfos mRNA表达于损伤后30 min、60 min、120 min，cjun mRNA表达于损伤后15 min、30 min、60 min、120 min显著升高（均P<0.05）；而尼莫地平组与对照组各时间点cfos、cjun mRNA表达比较差异无统计学意义。与损伤组比较，尼莫地平组cfos、cjun mRNA表达于30 min、60 min、120 min明显降低（均P<0.001）。不同剂量尼莫地平预处理后，cfos mRNA的表达随尼莫地平剂量的增加而逐渐减少，各剂量组间比较差异有统计学意义（均P<0.05），cfos mRNA表达水平与用药剂量呈负相关（r=-2.663,P<0.05）；cjun mRNA表达各剂量组间比较差异无统计学意义，亦无剂量相关性。结论 急性外周神经损伤时应用钙离子拮抗剂尼莫地平，早期通过抑制cfos、cjun mRNA的表达，对外周神经损伤有一定的保护作用。    【关键词】  尼莫地平；cfos；cjun；神经保护作用　　Effects of Nimodipine on the cfos and cjun mRNA expressions in dorsal root ganglia of rate following acute injury  YAO Xu, DING Xinsheng, TANG Jinrong, et al.Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China    Abstract：Objective  To explore the effects of Nimodipine on oncogene cfos and cjun mRNA expressions in dorsal root ganglia of rats following acute sciatic nerve injury. Methods  Nimodipine at a dose of 10 mg/kg at 5, 15, 30, 60 and 120 min and at a different dose of 2.5, 5 and 10 mg/kg at 60 min was given to each rat through intraperitoneal injection before transection of sciatic nerve. Using reverse transcription PCR (RTPCR) technique, the cfos and cjun mRNA expressions were detected at 5, 15, 30, 60 and 120 min after injection of Nimodipine and following acute sciatic nerve injury.Results  Compared with control group, the expressions of cfos mRNA in injury group were obviously increased at 30, 60 and 120 min after injury (all P<0.05). cjun mRNA expressions were also increased at 15, 30, 60 and 120 min (all P<0.05). There was no significant difference in the cfos and cjun mRNA expressions between Nimodipine group and control group. Distinctly decreased expressions of cfos and cjun mRNA were seen in Nimodipine group at 30, 60 and 120 min, compared with injury group (all P<0.001). In different dose group, the cfos mRNA expression was gradually reduced with the raise of Nimodipine in dose. It was a remarkable difference between each other group at a different Nimodipine dose of 2.5, 5 and 10 mg/kg (all P<0.05). cfos mRNA expression was moderately negatively related to the dose of Nimodipine (r=-2.663, P<0.05). There was no obvious difference in the expression of cjun mRNA among different dose group.Conclusions  Nimodipine can significantly inhibit the cfos and cjun mRNA expressions in rat dorsal root ganglia. It may have neuroprotective effect on the early acute peripheral nerve injury period.     Key words：Nimodipine;cfos;cjun;neuroprotective effect　　由缺血、机械性损伤等造成的神经系统疾病和损伤，可引起即早基因（IEGs）cfos、cjun表达增强。本研究选择大鼠坐骨神经切断模型，采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术，观察钙离子拮抗剂尼莫地平对急性外周神经损伤后背根神经节cfos、cjun mRNA表达的影响，探讨其神经保护机制。1  材料与方法　　1.1  材料　　1.1.1  动物及分组  SD大鼠42只，雌雄不限，质量240～270 g，南京医科大学动物实验中心提供。将大鼠随机分为正常对照组(3只)、损伤组及尼莫地平组。损伤组和尼莫地平组依据制模后不同时间点分为5个亚组（5 min、15 min、30 min、60 min、120 min），每组3只。另有9只大鼠依照制模前应用不同剂量的尼莫地平预处理分为低剂量组（2.5 mg/kg）、中剂量组（5 mg/kg）及高剂量组（10 mg/kg），每组3只。　　1.1.2  主要仪器及试剂  低温高速离心机；紫外分光光度仪；PCR扩增仪；电泳仪、电泳槽；全自动凝胶图像分析系统。RNA提取试剂（Invitrogen公司产品No.15596026）；逆转录试剂盒（Promega公司）；尼莫地平注射液（尼莫同，德国拜耳公司）。　　1.2  方法　　1.2.1  药物干预方法  尼莫地平组大鼠制模前10 min予以腹腔注射尼莫地平10 mg/kg 1次。低、中、高剂量组大鼠制模前10 min分别给于相应剂量的尼莫地平腹腔注射1次，正常对照组及损伤组无药物预处理。　　1.2.2  动物模型制备  采用Kenney等［1］方法改良后，大鼠给予腹腔注射硫贲妥钠（50 mg/kg）麻醉后俯卧位固定，背侧中线切口，在L4、L5会聚处分离出右侧坐骨神经并用丝线结扎，于近端处用虹膜手术剪剪去2.0 mm，缝合伤口。正常对照组不手术。　　1.2.3  标本采集及处理  各组于相应时间点，迅速取损伤侧L4、L5背根神经节，置于液氮瓶中-70℃冰箱中保存待用。　　1.2.4  cfos mRNA及cjun mRNA的检测  （1）背根神经节RNA提取：按试剂盒说明操作。（2）RTPCR引物序列：cfos上游为5′ATGATGTTCTCGGGTTTCAA3′，下游为5′TGACATGCTCTTCACCACTC3′，扩增片段长度为348 bp；cjun上游为5′ATGACTGCAAAGATGGAAAC3′，下游为5′TTGAAGTTGCTGAGGTTGGC 3′，扩增片段长度为530 bp。内对照βactin的引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成，序列上游为5′CCACGAGAAGATGACCCAGAT 3′，下游为5′GAAGCATTTGCGGTGGACGA 3′，扩增片段长度为877 bp。（3）RTPCR：提取后的RNA于70℃孵育10 min后置于冰上备用,配制RT反应液20 μl,按下列条件进行RT：室温（30℃）10 min，42℃ 5 min，95℃ 5 min，5℃ 5 min。RT完成后配制PCR反应液，按下列条件进行扩增：95℃预变性2 min后，进入95℃变性1 min，55.5℃(cfos)/56℃(cjun)退火1 min，72℃延伸1 min，共循环35次，最后72℃延伸2 min。（4）反应完毕后将PCR产物加入加样缓冲液，置1%琼脂糖凝胶，80V恒压电泳30 min。用PCR Marker作分子量标准，电泳完毕后在紫外光灯下观察，进行阳性条带密度扫描，计算mRNA指数（RI）。RI越高，mRNA水平越高。RI= cfos、cjun mRNA扫描值/βactin扫描值×100%。PCR结果经图像分析软件作半定量分析。　　1.2.5  统计学方法  实验数据用均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 10.0统计软件，成组间比较运用单因素方差分析。不同剂量组的组间比较采用ANOVA及线性回归分析。2  结果　　2.1  各组各时间点cfos mRNA、cjun mRNA表达水平的比较  见图1、表1。与正常对照组比较，损伤组及尼莫地平组的12345（5 min、15 min、30 min、60 min、120 min）cfos mRNARI于损伤后30 min、60 min、120 min显著升高（均P<0.05），cjun mRNA于损伤后15 min、30 min、60 min、120 min显著升高（均P<0.05）。尼莫地平组cfos mRNA、cjun mRNARI与正常对照组比较各时间点差异均无统计学意义；与损伤组比较，其cfos mRNA、cjun mRNA RI于30 min、60 min、120 min明显降低（均P<0.001）。　　图1  尼莫地平组、损伤组各时间点cfos、cjun  mRNA的表达（略）　　M为Marker（2000 bp-2000、1000、800、500、200、100 bp）。c-fos、c-jun、β-actin的阳性条带见于损伤组的123456（正常对照组、5 min、15 min、30 min、60 min、120 min）　　2.2  不同剂量尼莫地平对cfos mRNA、cjun mRNA表达的影响  见图2、表2。不同剂量组间cfos mRNA表达水平随剂量的加大而逐渐减少，差异有统计学意义（均P<0.05），呈剂量负相关（r=-2.663,P<0.05）；cjun mRNA表达各剂量组间差异无统计学意义，亦无剂量相关性。　　表1  各组、各时间点cfos mRNA、cjun mRNA RI的比较（略）　　注：与损伤组比较*P<0.001；与正常对照组比较△P<0.05，　　图2  不同剂量尼莫地平对cfos、cjun mRNA表达的影响（略）　　M为Marker（2000 bp-2000、1000、800、500、200、100 bp）。cfos、cjun、βactin的阳性条带见于123（低、中、高剂量组）　　表2  不同剂量尼莫地平预处理组cfos mRNA、cjun mRNA RI的比较（略）　　注：与中剂量组比较△P<0.05；与高剂量组比较*P<0.053  讨论　　cfos mRNA、cjun mRNA为IEGs的家族成员，其表达产物为细胞核的磷酸蛋白，在神经细胞对外界刺激应答中起中介作用，是神经元激活的标志之一［2］，参与神经系统对各种刺激所发生的立即和长时程反应过程。cfos、cjun mRNA的表达早期出现在损伤后存活的神经元中［3］，其表达水平可作为判断损伤后神经元功能状态的有效指标。　　正常组织内都有低水平的cfos、cjun mRNA表达，在多种病理条件下可引起不同程度的表达变化，并且与刺激种类、性质、强度和持续时间有关［4］。cfos mRNA作用的发挥与cjun密切相关,cjun和cfos mRNA编码的蛋白fos与jun在细胞内形成二聚体，构成转录因子激活蛋白1（AP1）的主要部分，作为第三信使［5］ 参与细胞信息传递;在病理状态下与许多疾病的发生、发展有关，在再生、修复、凋亡等方面都起着重要作用。　　坐骨神经切断后，神经细胞可出现神经生长因子缺乏、受体缺失、Ca2+内流、氧自由基增多、兴奋性氨基酸升高等生化条件改变。兴奋性氨基酸升高，可通过激活花生四烯酸代谢级联反应等使活性氧类生成增加，导致氧化应激发生。氧化应激则可通过抑制钙调蛋白依赖的过程、动员线粒体该库内Ca2+的释放等增加胞质内游离Ca2+的水平。这些最终引起细胞内Bcl2的表达降低、Bax的表达增高，导致神经细胞的凋亡和死亡。　　大量证据表明，谷氨酸N甲基D天冬氨酸（GluNMDA）受体激活是IEGs表达的关键因素，而受体活化引起的细胞内Ca2+和蛋白激酶C（PKC）第二信使系统是表达的必要条件［6］。Murphy等［7］认为Glu 受体活化是刺激cfos基因表达的主要途径，应用NMDA受体拮抗剂能明显减少cfos mRNA和cjun mRNA的表达。Morgan等［8］认为NMDA可促使cfos mRNA的表达作用，并与增强磷脂酰肌醇(PI)的降解、PKC激活及钙通道开放有关。　　体外研究［9］表明，钙通道激动剂可诱导IEGs的表达，而钙通道拮抗剂则抑制IEGs的表达，这提示细胞内Ca2+是调控IEGs表达的另一主要因素。　　本实验运用Ca2+拮抗剂尼莫地平腹腔注射，观察其对大鼠坐骨神经切断模型的L4、L5背根神经节cfos mRNA、cjun mRNA表达的影响。尼莫地平属于L型Ca2+拮抗剂，其半衰期是1.1～1.7 h，于0.6 h达血浆峰值浓度。本研究结果表明尼莫地平对cfos mRNA、cjun mRNA的表达有明显的阻断作用，在30 min、60 min、120 min时与损伤组比较,差异有统计学意义，且cfos mRNA的表达随尼莫地平的浓度的增高而逐渐降低，存在剂量负相关；cjun mRNA的表达则无剂量相关性。提示cjun mRNA的表达可能还受除Ca2+以外的其他物质影响，损伤时细胞内Ca2+增高刺激cjun mRNA表达，却抑制了其他刺激cjun mRNA表达的因素。当损伤后的适应抑制了钙通道后，其他因素得以激活，并增强cjun mRNA的表达，故而cjun mRNA对钙拮抗剂浓度的增加不敏感。    本实验结果提示，急性外周神经损伤可引起cfos mRNA、cjun mRNA表达的增强，钙离子拮抗剂预处理可抑制其的表达，并且对cfos mRNA的抑制有剂量相关性。cfos mRNA、cjun mRNA的表达可作为研究外周神经损伤后细胞代谢改变的一项指标，测定药物对损伤干预作用的一种方法，在实际应用中有很大潜力，为外周神经损伤的防治提供实验室依据。【参考文献】　　［1］Keney AM,Kocsis JD.Peripheral axotomy induces longterm cjun aminoterminal kinase1 activation and activator protein1 landing activity by cjun and junD in adult rat dorsal root ganglia in vivo［Ｊ］.J Neurosci,1998,18:1318.　　［2］Radhakrishna M, Almazan G.Protein kinases mediate basic fibroblast growth factors stimulation of proliferation and cfos induction in oligodendrocyte progenitors［Ｊ］.Brain Res Mol Brain Res, 1994, 24: 118.　　［3］Takemoto O, Tomimoto H, Yanagihara T.Induction of cfos and cjun gene products and heat shock protein after brief and prolonged cerebral ischemia in gerbils［Ｊ］.Stoke, 1995, 26: 1639.　　［4］Jang MH, Chang HK, Shin MC, et 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