结缔组织生长因子介导高糖诱导肾小管上皮细胞肥大的机制

　　作者：汤珣1,曾莉3,蔡德鸿2　　作者单位：南方医科大学 1. 珠江医院肾内科, 2. 珠江医院内分泌科, 广东 广州510280;3. 公共卫生与热带医学学院, 广东 广州 510515

　　【摘要】【目的】 研究高糖诱导肾小管上皮细胞肥大的作用途径及可能机制。【方法】 HK-2细胞分正常对照组(培养基含葡萄糖1 g/L),等渗对照组(葡萄糖1 g/L + 甘露醇3.5 g/L)和高糖组(葡萄糖4.5 g/L)培养。收集各组培养至24 h,48 h,96 h的细胞,检测结缔组织生长因子(CTGF)。p27kip的mRNA水平。CTGF。p27kip的蛋白水平。细胞增殖活力。细胞周期分布及细胞总蛋白含量。另外检测各组培养30 min。1 h。24 h。48 h时的磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)水平。每个检测指标设3个重复样本。 【结果】 高糖刺激可引起HK-2细胞的CTGF。p27kip的mRNA及蛋白表达水平显著升高,ERK1/2磷酸化激活,阻滞于G1期的细胞显著增多,细胞增殖活力受抑制,细胞肥大主要指标胞内蛋白总含量进行性增高。 【结论】 证实了高糖可通过上调CTGF激活ERK1/2信号转导,从转录水平上调p27kip,从而使增殖细胞阻滞于G1期诱导细胞肥大。

　　【关键词】 结缔组织生长因子; 肾小管上皮细胞; 肥大; p27kip; 细胞外信号调节激酶1/2

　　中图分类号: R587.1 文献标志码: A 文章编号: 1672-3554(2010)02-0225-06

　　Mechanism of Tubular Epithelial Hypertrophy Induced by High Glucose

　　TANG Xun1, ZENG Li3, CAI De-hong2, ZHANG Jun1

　　1. Department of Nephrology, Zhujiang Hospital, 2. Department of Endocrinology, Zhujiang Hospital,Guangzhou 510280, China; 3. Department of Epidemiology, School of Public Health and Tropical Medicine,Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

　　Abstract: 【Objective】 To study the mechanism of tubular epithelial hypertrophy induced by high glucose. 【Methods】 Human tubular epithelium line HK-2 cells were cultured in DMEM/F12 medium containing 1 g/L glucose (normal control group), 4.5 g/L glucose (high glucose group), and 1 g/L glucose + 3.5 g/L mannitol (iso-osmia control group), respectively. The cells of every group after cultured for 24 h, 48 h, and 96 h were collected. The mRNA levels of CTGF and p27kip were detected by real-time PCR. The protein levels of CTGF and p27kip were detected by Western blot. The cellular proliferative activities were observed by MTT. The total cellular protein contents were detected by Bradford method. The cell cycle process was analyzed by flow cytometry. The cells of every group after being cultured for 30 min, 1 h, 24 h, and 48 h were collected. The levels of phospho-ERK1/2 were detected by Western blot. Every step was repeated for 3 times. 【Results】 High glucose could significantly up-regulate the mRNA and protein levels of CTGF and p27kip, activate ERK1/2 signal conductive pathway in HK-2 cells, make more cells arrest in G1 phase, decrease cellular proliferative activities, increase total cellular protein content reflecting cellular hypertrophy. 【Conclusion】 CTGF is an important mediator of tubular epithelial hypertrophy induced by high glucose. The mechanism is that CTGF up-regulates the p27kip expression through activating ERK1/2 pathway. Up-regulated p27kip lead proliferative cell to be arrested in G1 phase and cause cellular hypertrophy.

　　Key words: connective tissue growth factor; tubular epithelial cell; hypertrophy; p27kip; extracellular signal-regulated kinase 1/2

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci),2010,31(2):225-230]糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)

　　早期最重要的病理生理学特征是肾脏肥大。肾小管体积约占整个肾脏体积的90%,因而肾小管上皮细胞(tubular epithelia cell, TEC)肥大是肾脏肥大的主要原因。研究表明, TEC肥大可能是导致肾小管间质纤维化的重要前奏[1],因此了解TEC肥大的发生机制,对于早期防治肾小管间质纤维化具有十分重要的意义。目前多种生长因子被证实与DN的发生发展密切相关。其中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)因参与了DN发病多个环节及病理进程在近年来在的研究中倍受关注[2]。在STZ加单肾切除诱导的DN大鼠模型早期即见到肾小球及肾小管表达CTGF蛋白水平升高,且与肾小球。肾小管肥大程度呈正相关[3]。提示CTGF介导了DN早期的肾脏肥大。但关于CTGF介导肾脏肥大的具体机制仍不清楚,尤其CTGF 与肾小管肥大关系的研究鲜见报道。体外试验已证实高糖可引起TEC肥大[4],本试验拟研究高糖诱导HK-2细胞肥大的可能机制及CTGF在其中的作用途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞株与试剂

　　HK-2细胞株为人TEC的永生系,购自美国ATCC细胞库。DMEM/F12培养基。ThermoScript RT-PCR Kit。HRP Western Blot Detection Kit购自Invitrogen公司。CTGF。p27kip及内参照GAPDH引物由广州博川生物技术公司合成;兔抗人CTGF抗体购自Abcam公司;兔抗人p27kip抗体购自北京博奥森公司;兔抗人phospho-ERK1/2购自Santa Cruz公司。

　　1.2 HK-2细胞分组培养

　　细胞分3组培养:分别在含D-葡萄糖1 g/L,D-葡萄糖1 g/L + 甘露醇3.5 g/L,D-葡萄糖4.5 g/L的DMEM/F12完全培养基中传代培养,分别为正常对照组,等渗对照组,高糖组。

　　1.3 Real time PCR检测

　　用Trizol分别提取各样本细胞总RNA。合成CTGF。p27kip及内参GAPDH 引物:CTGF(扩增长度81 bp) 上游5′-AGCCGCCTGTGCATGGT-3′,下游5′-GGGAGTACGGATGCACTTTTTG-3′;p27kip(扩增长度122 bp) 上游5′- CCTGCAACCGACGATTC TTC-3′,下游5′- CTTCTGAGGCCAGGCTTCTT-3′;GAPDH(扩增长度96bp)上游 5′-AGCCTCAAGAT CATCAGC-3′,下游5′-GAGTCCTTCCACGATACC-3′。参照试剂盒说明书操作:反转录合成cDNA;引物溶解后使用普通PCR反应进行条件优化,反应条件为95 ℃ × 3 min,94 ℃ × 25 s。60 ℃ × 25 s。72 ℃ × 25 s共30个循环,72 ℃ × 10 min;Real Time PCR扩增和检测,反应条件为95 ℃ × 2 min,94 ℃ × 15 s。 60 ℃ × 25 s。 72 ℃ × 35 s 40个循环。对仪器采集到的图像进行软件分析,得到样品量的参数Ct值(循环阈值)。以2-ΔΔCt表示基因的相对表达量,ΔΔCt = [Ct(待测基因)-Ct (GAPDH)]试验组-[Ct(待测基因)-Ct (GAPDH)]对照组[5]。

　　1.4 Western blot分析

　　用细胞质蛋白提取试剂抽提细胞质蛋白,操作遵试剂说明,提取胞浆蛋白,BCA(bicinchoninic acid)法行蛋白定量,SDS-PAGE电泳,电转法将蛋白转至硝酸纤维素滤膜上,封闭后,先后与第一抗体及羊抗兔多克隆二抗孵育杂交,最后以化学发光法在X线片自显影显示结果,扫描并分析结果的光密度值,以待测蛋白和内参照β-actin条带积分光密度值的比值代表待测蛋白的相对含量,独立实验重复3次。

　　1.5 MTT法测定细胞增殖活力

　　按各实验组设定条件将细胞接种于96孔板上,分别在24 h。48 h。96 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,振荡混匀,避光37 ℃;体积分数5% CO2孵箱中继续孵育4 h,终止培养;每组每个时间点设3个复孔;吸弃孔内培养上清液后,每孔加入150 μL DMSO,振荡10 min溶解结晶;以空白对照孔调零,酶标仪492 nm处测定各孔吸光度值D(492 nm),计算各组细胞的平均D(492 nm)。

　　1.6 流式细胞仪测定细胞周期分布

　　消化。收集细胞,用PBS制成单个细胞悬液;750 mL/L乙醇4 ℃固定1 h;PBS洗涤3次,调整细胞浓度,每份样品细胞数目为5 × 105左右;加入50 μL RNase(10 μg/mL)和200 μL PI(5 μg/mL),室温下避光染色30 min后上机测试;每组设3个重复样本。

　　1.7 考马氏亮蓝法测定细胞总蛋白含量

　　弃去上清,计数细胞,每孔加0.5 mol/L NaOH 1 mL,37 ℃孵育30 min。按照试剂盒说明绘制标准曲线并测定样本的蛋白质含量,用可见光分光光度计在波长595 nm处测定吸光度值,以0.5 mol/L NaOH溶液为空白对照调零。根据标准曲线读取待测样本蛋白质浓度。根据每孔细胞数,计算细胞的蛋白质含量,最后结果以mg/106 细胞表示。每组设3个复孔。

　　1.8 统计学处理

　　采用SPSS11.0统计软件包分析,实验数据以均数 ± 标准差(x ± s)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析或析因方差分析,P < 0.05 视为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 Real time PCR检测各组CTGF mRNA的表达水平

　　Real time PCR的结果显示,各组样本都有不同程度的CTGF基因扩增,溶解曲线显示扩增的为特异序列(图1)。

　　各组CTGF mRNA相对表达量结果提示:正常对照与等渗对照组差异无统计学意义,证明渗透压对CTGF mRNA表达无影响。高糖组表达水平在各时间均高于正常对照组(P = 0.000),48 h达峰值(表1)。

　　2.2 Western blot测定各组CTGF的蛋白表达水平

　　各组24。48。96 h的细胞质蛋白表达水平结果提示:正常对照与等渗对照组差异无统计学意义,证明渗透压对CTGF蛋白表达无影响。高糖组表达水平在各时间均高于正常对照组(P = 0.000),且随时间延长进行性升高(图2。3)。

　　2.3 Real time PCR检测各组p27kip mRNA的表达水平

　　实验测得各组p27kip mRNA的相对表达量见表2,结果提示:正常对照与等渗对照组差异无统计学意义,证明渗透压对p27kip mRNA表达无影响。高糖组表达水平在各时间均高于正常对照组(P=0.000),48 h达峰值。

　　2.4 Western blot测定各组p27kip的蛋白表达水平

　　结果提示正常对照与等渗对照组差异无统计学意义,证明渗透压对p27kip蛋白表达无影响。高糖组表达水平在各时间均高于正常对照组(P = 0.000),24 h已达峰值(图4。5)。

　　2.5 Western blot测定各组磷酸化细胞外信号调节激酶1/2的蛋白表达水平

　　结果提示正常对照与等渗对照组差异无统计学意义,证明渗透压对p-ERK1/2水平无影响。高糖组表达水平在各时间均高于正常对照组(30 min:P = 0.000; 1 h: P = 0.005; 24 h: P = 0.002; 48 h: P = 0.000)(图6。7)。

　　2.6 MTT法检测各组细胞增殖活力

　　以各组细胞的平均吸光值代表增殖活力,结果提示24 h时各组间增殖水平差异无统计学意义;高糖组48 h。96 h低于正常对照组(P = 0.002,图8)。

　　2.7 流式细胞仪测定细胞周期分布

　　以流式细胞仪分析各组细胞周期分布,并比较各组G0/G1细胞所占百分数。结果提示正常对照与等渗对照组差异无统计学意义,高糖组在各时间点G0/G1细胞百分比均高于正常对照组(24 h:P = 0.011; 48 h: P = 0.002; 96 h: P = 0.000),并随时间延长进行性升高(图9,表3)。

　　2.8 考马氏亮蓝法测定细胞总蛋白含量

　　结果提示24 h各组差异均无统计意义;48 h。96 h时高糖组均高于正常对照组(48 h:P = 0.038;96 h:P = 0.002),且随时间延长细胞总蛋白含量进行性升高(表4)。

　　3 讨 论

　　目前关于DN时TEC肥大的具体机制仍不清楚。已知细胞的增生及肥大往往与细胞周期的转换密切相关。正常情况下肾小管上皮细胞均处于静息期即G0期。当细胞需要增殖时即进入G1期,如果某些因素导致细胞停滞在G1期无法进入S期,则会引起蛋白在细胞内聚积,细胞肥大[6]。本实验显示高糖条件培养下的HK-2细胞出现增殖活力受抑制,随时间延长停滞于G1期的细胞进行性增多,反映细胞肥大的主要指标胞内总蛋白含量也进行性增多。这一结果与上述理论相符。本实验还表明等渗对照组同正常对照组比较并没有发生细胞周期变化及细胞总蛋白含量增多,提示细胞周期转换抑制。细胞肥大是由高糖诱发的,而与渗透压无关。

　　作为细胞周期素激酶抑制剂(CDK inhibitors, CKI)的CIP/KIP家族具有抑制细胞周期转换的作用,因此其在DN发病早期肾脏固有细胞肥大中的作用倍受关注。CIP/KIP家族包括p21kip。p27kip。p57kip三个成员。肾小管上皮细胞主要以表达p27kip,p21kip为主,p57kip则尚未见文献报道。

　　体外及体内研究提示在高糖及糖尿病状态时肾小管上皮细胞p27kip蛋白表达增加,并与细胞肥大呈正比[4,7]。然而DN时p27kip表达上调的具体机制仍不清楚。Huang等[4]发现高糖引起体外培养的肾小管上皮细胞肥大,p21kip和p27kip表达升高的同时伴有ERK1/2的磷酸化激活,提示MAPK信号途径可能是高糖刺激肾小管上皮细胞表达p27kip的细胞内机制。

　　MAPK信号途径如何被激活,其具体机制是什么还有待探索。近年来CTGF由于在DN的发生和发展中起了重要作用而倍受关注。有实验证明CTGF可激活肾小球系膜细胞和肾间质细胞的ERK1/2通路引起细胞形态功能变化[8-9];我们的研究已发现高糖可通过p38MAPK途径上调人肾小管上皮细胞的CTGF表达水平[10];新近研究又发现CTGF是血管紧张素Ⅱ诱导人近端肾小管上皮细胞肥大的重要介质。因此我们推测高糖可能是通过上调CTGF表达继而激活ERK1/2通道来调节p27kip的表达从而诱导肾小管上皮细胞肥大。故在本研究中我们检测了高糖条件下培养的人肾小管上皮细胞CTGF。p27kip的mRNA及蛋白表达水平,磷酸化ERK1/2水平以及细胞肥大相关指标。结果显示高糖刺激可引起HK-2细胞的CTGF。p27kip 的mRNA及蛋白表达水平显著升高;ERK1/2磷酸化激活;被阻滞于G1期的细胞显著增多;细胞增殖活力受抑制;细胞肥大主要指标胞内蛋白总含量进行性增高。证实了CTGF是介导高糖诱导肾小管上皮细胞肥大的重要因子,而这一作用是通过激活ERK1/2信号转导,上调p27kip转录水平,使增殖细胞周期停滞于G1期,从而抑制细胞的增殖引起的。

　　【参考文献】

　　Zeisberg M, Strutz F, Muller GA. Renal fibrosis: an update[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2001, 10(3): 315-320.

　　Mason RM. Connective tissue growth factor (CCN2), a pathogenic factor in diabetic nephropathy. What does it do。 How does it do it。 [J]. J Cell Commun Signal, 2009, 3(2): 95-104.

　　Liu BC, Chen L, Sun J, et al. Connective tissue growth factor-mediated angio- tensin II-induced hypertrophy of proximal tubular cells [J]. Nephron Exp Nephrol, 2006, 103(1): 16-26.

　　Huang JS, Chuang LY, Guh JY, et al. Antioxidants attenuate high glucose-induced hypertrophic growth in renal tubular epithelial cells[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2007, 293(4): 1072-1082.

　　Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method [J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

　　Shankland SJ. Cell cycle regulatory protein in glomerular disease[J]. Kidney Int, 1999, 56(4): 1208-1215.

　　Liu BC, Huang HQ, Luo DD, et al. Connective tissue growth factor is associated with the early renal hypertrophy in uninephrectomized diabetic rats[J]. Chin Med J, 2006, 119(12): 1010-1016.

　　Crean JK, Finlay D, Murphy M, et al. The role of p42/44MAPK and protein kinase B in connective tissue growth factor induced extracellular matrix protein production, cell migration, and actin cytoskeletal rearrangement in human mesangial cells[J]. J Biol Chem, 2002, 277(46): 44187-44194.

　　黄海长, 杨 敏, 李惊子, 等. 结缔组织生长因子通过活化Erk21/2信号通路促成肌纤维细胞生成[J].中华医学杂志,2005,85(19):1322-1326.

　　汤 珣, 章 俊, 蔡德鸿, 等. 高糖对肾小管上皮细胞表达CTGF的影响及p38MAPK通路在其中的作用[J]. 南方医科大学学报, 2009, 29(1): 50-53.