iNOS表达与喉癌组织中淋巴管生成及血管生成的相关性分析

作者                 作者单位

王　莹     牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江 牡丹江　157011

李文媛     牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江 牡丹江　157011

刘艳翠     牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江 牡丹江　157011

管业秋     牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江 牡丹江　157011

丁　利     牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江 牡丹江　157011

赵斯达     牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江 牡丹江　157011

[ABSTRACT] Objective：To investigate the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in patients with laryngeal carcinoma， and the relationship with lymphangiogenesis， angiogenesis and their prognosis significance.Methods： The expressions of iNOS in 45 specimens of the laryngeal cancer and 20 specimens of polyp of vocal cord tissues were observed by immunohistochemistry and real-time fluorescent quantitative PCR. LVD was evaluated by 5′-Nucleotides staining， MVD was evaluated by CD34， and the correlation analysis was made between iNOS and clinical patho-character. The role of iNOS in laryngeal carcinoma prognosis was analyzed by Kaplan-meier. Results： The expression of iNOS was significantly higher in laryngeal cancer tissue than in the polyp of vocal cord tissue(P<0.05)， the expression of ET-1 was significantly correlated with intratumoral and peritumoral LVD， MVD， lymph node metastasis， lymphovascular invasion， and TNM clinical stage(P<0.05). The expression of iNOS was correlation with the survival ratio (P<0.05). Conclusions：The expression of iNOS is correlated with lymphangiogenesis and angiogenesis. Detection the expression of iNOS may be helpful for judging prognosis in laryngeal cancer.

[KEY WORDS]Inducible nitric oxide synthase; Laryngeal carcinoma; Lymphangiogenesis; Angiogenesis

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，占耳鼻咽喉科恶性肿瘤的7.9%～15.0%。淋巴转移是喉癌最常见的转移方式，因而研究喉癌淋巴管生成和转移机制具有重要的临床价值[1,2]。近年来发现诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在多种实体肿瘤中过度表达，是肿瘤一氧化氮(nitric oxide synthase，NO)的主要来源，并证明iNOS与肿瘤的血管生成和肿瘤生长转移密切相关[3]，但对于iNOS是否促进肿瘤淋巴管生成尚不明确，为此，本研究探讨了喉癌中iNOS的表达及其与微血管密度(MVD)、淋巴管密度(LVD)、淋巴结转移和喉癌预后的关系，为喉癌的诊治研究提供新的思路。

1　资料与方法

1.1　临床资料

选取中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科2004年1月～2009年3月首次经手术治疗的原发喉癌患者45 例，女性43例，男性2例，年龄平均63.5岁。声门上17例，声门23例，声门下5例。按国际抗癌协会(UICC)1997年TNM分期标准，T1N0M0 6例，T2N0M0 6例，T2N1M0 2例，T3N0M0 14例，T3N1M0 9例，T4N0M0 2例，T4N1M0 5例，T4N2M0 1例。有颈淋巴结转移17例，淋巴管侵润18例。随访至2009年6月1日，随访时间3～71个月，平均31个月，死亡10例，其中呼吸困难2例，远处转移4例，其他疾病3例，原因不明1例。对照组20例，均为声带息肉手术切除病例。

1.2　主要试剂

二甲胂酸钠，腺苷-5′-磷酸钠，萘酚AS-MX磷酸钠，左旋咪唑，固蓝BB盐，二甲基甲酰胺(DMF)均购自美国SIGMA公司。iNOS、CD34及SP试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Trizol试剂、Superscript Ⅱ反转录酶、dNTPs购自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶、DL2000DNA标志物购自Takara公司，iNOS和β-actin引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.3　免疫组织化学染色

严格按照免疫组化试剂盒说明书的步骤进行，其中一抗浓度iNOS(1∶100)、CD34(1∶100)。以PBS代替一抗作阴性对照。评分标准按照细胞着色强度(无：0分;弱：1分;中：2分;强：3分)和切片中阳性细胞率评分(≤5%：0分;6%～10%：1分;11%～20%：2分;21%～50%：3分;>50%：4分)之和为该病例评分值，将评分值≤2分定为阴性，≥3分定为阳性。MVD定量分析采用Weidner等[4]制定的方法确定。

1.4　酶组化染色方法[5]

LVD定量分析：先在低倍镜下选择淋巴管最丰富区域，在高倍镜下计数5个视野淋巴管数，取其均值作为该切片淋巴管数。

1.5　实时荧光定量PCR检测

总RNA提取，采用Zacharek等[6]报道的方法进行PCR反转录、检测及荧光定量分析。引物设计及合成按照已报道的序列设计并合成iNOS以及内参照β肌动蛋白β-actin的特异性引物。各引物的序列为： iNOS：上游5′-GAG-CTTCTACCTCAAGCTATC-3′，下游5′-CCTGATGTTGCCA-TTGTTGGT-3′;β-actin： 上游5′-TGAAGGTCGGTGTCAACGGA-3′，下游5′-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′。分析方法采用 2 - △△ CT 方法。

1.6　统计学处理

应用SPSS 11.5统计软件进行数据处理。计数资料比较采用χ2检验，两组间LVD、MVD比较采用t检验，荧光定量PCR比较采用LSD法，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　iNOS的表达情况

iNOS阳性表达位于细胞浆和细胞膜内，呈棕黄色颗粒状，阴性细胞胞浆不着色(图1、2)。iNOS在喉癌组织中的阳性表达率为71.1%，而声带息肉组中未见阳性表达，差异有统计学意义(P<0.01)。图1　喉癌组织中iNOS的　　图2　声带息肉组织中iNOS阳性表达(SP×200) 　 　的阴性表达(SP×100)表1　iNOS在喉癌组织中的表达与临床病理学特征之间的关系

2.2　iNOS表达与临床病理特征的关系

在各种临床因素中，iNOS蛋白表达与TNM分期、淋巴结转移及淋巴管侵润密切相关(P<0.05)，而各组间年龄、性别、肿瘤部位及肿瘤分化程度的差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

2.3　iNOS表达与LVD、MVD的关系

5′-Nase特异性地表达在喉癌组织中毛细淋巴管内皮细胞，在光镜下可见呈棕黄色的点状(横切面)或条状(纵切面)，血管内皮细胞和肿瘤细胞未见表达(图3)。CD34免疫组化染色后将微血管内皮细胞胞浆染色棕黄色，标记微血管呈棕色管腔(图4)。iNOS蛋白表达与瘤内LVD、瘤周LVD、MVD均密切相关(P<0.05)(表2)。图 3　喉癌组织淋巴管(L)　　图4　喉癌组织CD34阳呈棕色，毛细血管(B)淡染　　性表达(SP×400) 　　 或不着色，瘤内淋巴管(→)　　呈条索状(SP×400)表2 　喉癌组织中iNOS表达与LVD、MVD表达的关系

2.4　实时荧光定量PCR的扩增效率检测

喉癌组织Ccbe1 mRNA在有淋巴结转移组(0.145±0.033)和无淋巴结转移组(0.084±0.002)的表达较声带息肉组(0.048±0.014)明显增加(P分别为0.001、0.026)，其中有淋巴结转移组中Ccbe1 mRNA表达显著高于无淋巴结转移组(F=23.512，P<0.01)。

2.5　生存率分析

按iNOS表达的不同将喉癌患者分为阴性表达组和阳性表达组两组， Kaplan-Meier生存分析绘出喉癌患者整体生存曲线，iNOS阳性表达组平均生存时间为(44.53±5.62)个月，阴性表达组平均生存时间为(63.16±5.04)个月，Log rank检验表明iNOS阳性表达与生存曲线负相关(χ2=5.367，P=0.021)。

3　讨论

一氧化氮(NO) 作为一种新发现的信使分子和生物活性因子，参与调节机体多种生理和病理过程，尤其是肿瘤病理过程。在体内NO由一氧化氮合酶(nitrieoxide synthase，NOS)催化而产生，NOS可分为诱导型 NOS(indueible nitric oxidesynthase，iNOS)和结构型NOS(constitutive nitric oxidesynthase，cNOS)两类，其中iNOS是NOS最活跃的亚型，在正常组织中不表达，主要在病理情况下诱导生成，催化机体产生大量的NO。近年来研究发现，iNOS诱导生成的NO可通过多种机制促进肿瘤发生、发展[7]：(1)增加DNA损伤;(2)癌基因激活;(3)抑制DNA修复酶和肿瘤抑制基因;(4)降低肿瘤细胞凋亡;(5)促进肿瘤转移;(6)促进肿瘤血管发生;(7)扩张肿瘤血管，改善肿瘤微循环。所以iNOS 的表达可被认为是肿瘤生物学行为中重要的调节因子。Zhang等[8]研究表明iNOS在肝癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌和黑色素瘤细胞中均有过量表达，动物实验中使用iNOS抑制剂可显著减少iNOS水平，抑制肿瘤细胞生长。在本研究中发现喉癌组织中iNOS表达显著增高，声带息肉组则未见其表达，而且iNOS高表达与喉癌TNM病理分期、淋巴结转移、淋巴管侵润密切相关，提示iNOS在喉癌的发生、发展和转移的多个阶段均发挥作用。

近年来iNOS对肿瘤血管生成的作用已成为肿瘤血管靶向治疗的热点[9]，但iNOS能否促进肿瘤淋巴管生成，目前仍不明确。本研究显示iNOS的高表达与MVD、瘤内和瘤周LVD、淋巴结转移和淋巴管侵润均显著相关，证实了iNOS不仅可以促进喉癌血管生成，还可以促进喉癌淋巴管生成，加速肿瘤细胞淋巴管侵润与淋巴结转移。其机制可能是iNOS诱导的NO能够作为信使分子在淋巴管内皮细胞内发挥信息传递作用，成为淋巴管内皮细胞增生的最直接信号，内皮细胞有了这个信号的传递，能使淋巴管内皮细胞增生，促进淋巴管生成[7,8]，但其具体机制仍有待深入研究。目前关于iNOS表达对喉癌预后影响的相关报道尚不多见[10]，本实验通过运用Kaplan-Meier法分析iNOS对喉癌整体生存率的影响，结果表明iNOS阳性表达与生存曲线负相关。因此，检测喉癌患者iNOS蛋白表达将有望成为判断喉癌预后的一个新指标。但此研究仅是针对一组有限喉癌患者数量的回顾性研究，结论仍需进一步证实。

综上所述，喉癌组织中iNOS能够促进喉癌淋巴管生成和血管生成，因此，iNOS在肿瘤血管新生和淋巴管新生中的作用及基于此的肿瘤抗血管和淋巴管新生的靶向治疗将开辟一条新的治疗途径。

【参考文献】

1　张群峰，徐海帆. 淋巴管-肿瘤治疗的新靶点[J]. 海南医学院学报，2009， 15(3)：293-295.

2　王莹，李文媛，贾桦，等.喉癌组织中VEGF-D表达与淋巴管生成及预后的关系[J].解剖科学进展，2011,17(2)：116-120.

3　 Chen CN， Hsieh FJ， Cheng YM， et al.Expression of inducible nitric oxide synthase and cyclooxyg-enase-2 inangiogenesis and clinical outcome of human gastric cancer[J]. J Surg Oncol， 2006,94(3)：226-233.

4　Weidner N，Folkman J，Pozza F， et al. Tumor angiogenesis，a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma[J].J Natl Cancer Inst,1992,84(3)：1875-1887.

5　王莹，李文媛，富泽龙，等.喉淋巴管的几种组织化学显色法比较观察[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2008,17(1)：70-73.

6　Zacharek A，Chen J，Cui X，et al.Angiopoietin1/Tie2 and VEGF/Flk1 induced by MSC treatment amplifies angiogenesis and vascular stabilization after stroke[J].Cereb Blood Flow Metab,2007,27(3)：1684-1691.

7　Massi D，De Nisi MC，Franchi A， et al.Inducible nitric oxide synthase expression in melanoma： implications in lymphangiogenesis[J]. Mod Pathol,2009 ， 22(1)：21-30.

8　 Zhang W， He XJ， Ma YY， et al. Inducible nitric oxide synthase expression correlates with angiogenesis， lymphangiogenesis， and poor prognosis in gastric cancer patients[J]. Hum Pathol ， 2011， 42(9)：1275-1282.

9　 Sappayatosok K， Maneerat Y，Swasdison S et al.Expression of pro-inflammatory protein， iNOS， VEGF and COX-2 in oral squamous cell carcinoma (OSCC)， relationship with angiogenesis and their clinico-pathological correlation[J].Med Oral Patol Oral Cir Bucal,2009 ,14(7)：319-324.

10　Singh S， Gupta AK. Nitric oxide： role in tumour biology and iNOS/NO-based anticancer therapies[J].Cancer Chemother Pharmacol,2011， 67(6)：1211-1224.