偏侧帕金森病猴模型黑质和纹状体一氧化氮合酶表达的变化

偏侧帕金森病猴模型黑质和纹状体一氧化氮合酶表达的变化作者：黄海东，顾建文，赵凯，卢敏，夏勋，李汛，黄识宇    作者单位：610083成都军区总医院神经外科    【摘要】  目的 探讨偏侧帕金森病（PD）猴模型黑质和纹状体一氧化氮合酶(NOS)表达的变化。方法对3只恒河猴经单侧颈内动脉注射1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶（MPTP）制备成偏侧PD猴模型后，应用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶（NADPHd）组化染色方法观察偏侧PD猴黑质和纹状体NOS阳性神经元表达的变化,并与正常猴比较。结果 偏侧PD猴MPTP毁损侧的黑质和纹状体的NOS阳性神经元数目较毁损对侧和正常猴明显增加(均P<0.01)，毁损对侧的黑质和纹状体NOS阳性神经元数目与正常猴比较差异无统计学意义。结论 偏侧PD猴黑质和纹状体NOS阳性神经元增多，由此引起一氧化氮（NO）合成和释放增多，可能对黑质和纹状体神经元的变性和死亡起重要作用。   【关键词】  帕金森病；一氧化氮合酶；黑质；纹状体　　Expressing changes of nitric oxide synthase in substantia nigra and striatum of hemiparkinsonism monkey model HUANG Haidong, GU Jianwen, ZHAO Kai, et al.Department of Neurosurgery, General Hospital of Chengdu Military Command, Chengdu 610083，China    Abstract：Objective  To investigate the expressing changes of nitric oxide synthase (NOS) in substantia nigra and striatum of the hemiparkinsonism monkey model. Methods  Three hemiparkinsonian rhesus monkey models were induced by injecting 1methyl4phenyl1,2,3,6 tetrahydropyridine (MPTP) unilaterally into the internal carotid artery. The expressing changes of NOSpositive neurons of substantia nigra and striatum in three hemiparkinsonism monkey models and one normal control monkey were observed by using NADPHdiaphorase histochemistry staining method. Results  The NOSpositive neurons were increased significantly in the substantia nigra and striatum of MPTP lesioned side of hemiparkinsonian monkey model compared to contralateral side and normal control monkey (all P<0.01), and no difference was found between contralateral side and normal control monkey.Conclusion  The excessive production of NO secondary to the increment of NOSpositive neurons in the substantia nigra and striatum of hemiparkinsonian monkey models can play important role in the mechanism of neuronal degeneration and death.    Key words：Parkinsons disease;nitric oxide synthase;substantia nigra;striatum　　帕金森病（PD）是常见于中老年人的缓慢进展的神经变性疾病，发病机制至今未明，目前认为氧自由基引起的氧化应激在PD发病机制中起重要作用［1,2］。应用神经毒素1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)建立的PD恒河猴模型是目前比较经典的模型，它可复制出人类PD的重要临床、病理和生化特征［3，4］。本研究通过还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶（NADPHd）免疫组化法观察偏侧PD猴模型黑质和纹状体的一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元表达的变化，以及NOS及一氧化氮（NO）在PD猴模型黑质和纹状体神经元的变性和死亡中的作用。1  材料与方法　　1.1  材料  中国云南产健康雄性恒河猴4只，由第四军医大学实验动物中心提供。年龄4～6岁，质量6.4～8.2 kg，平均7.5 kg。随机选取3只制作偏侧PD猴模型，另1只作为正常对照。MPTP和阿朴吗啡均为Sigma公司产品，速眠新(846合剂)为长春农牧大学兽医研究所产品。　　1.2  方法　　1.2.1  偏侧PD猴模型的制备  参照Eberling等［4］的方法，3只恒河猴在速眠新（0.1 ml/kg）肌肉注射麻醉下，切开颈部皮肤，经钝性分离暴露一侧颈总动脉，并血管夹暂时夹闭颈外动脉;将MPTP按1.0～1.2 mg/kg溶于2 ml生理盐水中缓慢注入颈总动脉。4～6 d后3只恒河猴逐渐出现MPTP毁损侧对侧肢体肌肉僵直并有时伴肢体姿势性震颤及自发性身体向MPTP毁损侧对侧旋转（1～2 r/min）等典型的PD症状，而MPTP毁损侧肢体未出现肌肉僵直及震颤等症状；在PD样症状稳定后（即制模术后约12 d左右），用Benazzouz评价量表［5］（专门用于偏侧PD猴模型行为评价的标准量表）进行评价，并给予肌肉注射阿朴吗啡0.1 mg/kg，观察其行为改变。当量表评分>8分，以及恒河猴均出现快速向MPTP毁损侧对侧旋转10～15 r/min，表明偏侧PD猴模型制备成功。　　1.2.2  标本采集  3只偏侧PD猴在制模术后40 d和1只正常猴，在速眠新（0.1 ml/kg）肌肉注射麻醉下，迅速开胸经左心室至升主动脉插管，先以2000 ml生理盐水冲洗血液，随后用冷的（4℃）含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS液（pH 7.4）先快后慢灌注固定。6～8 h后分离出脑的双侧黑质和纹状体，置于20%蔗糖中（4℃）直至组织沉底，用冰冻切片机切制连续切片，片厚30 μm，置于0.01 mol/L PBS中存放于4℃条件下。　　1.2.3  NADPHd组化染色  切片在0.01 mol/L PBS（pH 7.4）中漂洗3×10 min(室温)后，置于0.2 mg/ml的硝基四氮唑蓝、1 mg/ml的NADPH和含3 g/L Trition X100的0.1 mol/L PBS（pH 8.0）反应液内孵育1 h（37℃温箱），然后置于0.01 mol/L PBS（pH 7.4）内终止反应，充分漂洗后裱片、晾干、脱水、透明和封固。染成紫兰色细胞为NOS阳性神经元。　　1.2.4  结果观察和图像采集  光镜观察并应用软件（LSM）采集图像。分别选取每只动物双侧黑质和纹状体的切片各8张，200倍镜下，观察并计数每张切片NOS阳性神经元的数目，取均值。　　1.2.5  统计学方法  应用SPLM软件包进行数据处理，数据采用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析。2  结果    3只恒河猴均制模成功。正常猴双侧黑质和纹状体的NOS阳性神经元呈散在分布，数目较少，形状呈多极形、胞体较大、有2～5个较长突起，染色较深呈紫蓝色。偏侧PD猴MPTP毁损侧黑质和纹状体的NOS阳性神经元数目较对侧和正常猴明显增多（均P<0.01）；毁损对侧的黑质和纹状体的NOS阳性神经元数目均未发现明显变化。见图1及表1。　　表1  正常猴与偏侧PD猴黑质和纹状体NOS阳性神经元数目的比较（略）　　注：与正常猴比较*P<0.01　　图1  NADPHd组化染色见偏侧PD猴毁损侧黑质和纹状体的NOS阳性神经元数目较正常猴明显增多；A 正常猴黑质，B 正常猴纹状体，C 偏侧PD猴毁损侧黑质，D 偏侧PD猴毁损侧纹状体（略）3  讨论　　NO是一种广泛存在的不典型的新型神经递质和信使分子，在中枢神经系统中参与多种生理功能，一定条件下NO过量产生或释放时则具有神经毒性作用，介导许多神经系统疾病的神经细胞变性和死亡的病理过程。由于NO是一种气体分子，易扩散，半衰期仅3～5 s，故无法直接测定其在组织中的含量。NOS是NO合成的限速酶，是调节NO合成的最关键因素［6］，因此可以通过观察NOS在组织中表达的变化,间接反映NO含量的改变。NOS有3种同工酶即神经元型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）、诱导型NOS（iNOS），它们在合成NO的过程中均需要NADPH作辅酶参于电子传递，故它们均表达有NADPHd的活性特点。目前大多数学者［7］认为，分布于神经系统中的NADPHd就是一种NOS。由于测定NADPHd的组化染色方法简便、经济，无需特异性抗体，因此在大量研究中常常采用NADPHd组化法来显示NOS,从而间接分析NO含量的改变。　　应用MPTP建立PD模型的原理主要是通过MPTP抑制线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性以及由此诱发的氧化应激反应来产生对多巴胺（DA）能神经元的毒性作用［8］。MPTP是一种高选择性DA能神经毒素，其可通过血脑屏障进入脑内，主要在神经胶质细胞单胺氧化酶B（MAOB）作用下转化为1甲基4苯基吡啶离子(MPP+)，MPP+ 被DA转运体（DAT）主动摄取到黑质DA能神经元胞体内，再通过主动转运作用而进入线粒体，抑制线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性，使ATP合成减少，氧自由基生成增加，同时MPP+还可使细胞内乳酸堆积，Ca2+平衡紊乱，NO合成增加，谷胱甘肽(GSH)合成减少。这些因素均可加剧氧自由基的过度生成，降低细胞对氧自由基损伤的抵抗能力，最终导致黑质DA能神经元变性、死亡。　　本研究通过NADPHd组化法对偏侧PD猴模型黑质和纹状体NOS阳性神经元表达的变化进行研究，发现偏侧PD猴毁损侧黑质和纹状体NOS阳性神经元数目较毁损对侧和正常猴明显增多，提示偏侧PD猴黑质和纹状体NO合成和释放增多。此研究结果与Hunot等［9］及Bockelmann等［10］的研究结果一致。毁损侧黑质、纹状体NOS阳性细胞数量增多可能一是它们本身即含有NOS，但由于在正常情况下含量极低而未被染出；在病理情况下由于细胞内NOS含量增加而造成染出的细胞数量增多。另一种可能是该细胞在正常情况下并不含NOS，在病理情况下影响了NOS的转录、合成等机制，引起含NOS的神经元数量增多。既往的病理研究发现［11］，毁损侧黑质和纹状体的神经元有变性和死亡。由于当NO合成和释放增多时，几乎能与细胞内各种蛋白质起反应，抑制线粒体功能进而影响细胞呼吸和能量代谢、抑制DNA合成并损伤DNA；与超氧阴离子反应生成具有强氧化性的硝基过氧化物介导氧化应激反应，从而引起细胞毒性作用，导致神经细胞损伤，并最终导致神经细胞死亡。因此，本实验结果表明，NOS阳性神经元数目增多，NO合成和释放增多，对黑质和纹状体神经元的变性和死亡起重要作用。　　有研究 ［12-14］ 将MPTP注入小鼠或狒狒等动物体内，预先或同时注入NOS选择性抑制剂，发现这些抑制剂对MPTP所造成的黑质DA通路损害的各项指标有显著保护作用，包括抑制纹状体DA含量的耗竭、抑制黑质变性神经元的数量和酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元的减少，并认为这些抑制剂具有剂量、时间依赖性的针对MPTP的神经保护作用。【参考文献】　［1］Jenner P.Oxidative stress in Parkinsons disease ［Ｊ］.Ann Neurol, 2003, 53(suppl 3): S26.　［2］Tieu K, Ischiropoulos H, Przedborski 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