鼻咽癌放疗后化疗敏感性的变化

作者：卜俊国

【关键词】  鼻咽肿瘤；肿瘤细胞,培养的；基因,mdr1；P-糖蛋白；放射治疗；化疗敏感性

　　［摘要］  目的  检测鼻咽癌CNE1细胞X射线照射前后多药耐药基因（mdr1基因）及其编码产物P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是否表达，以及化疗药物敏感性的变化。方法  利用RT-PCR、Western blotting和流式细胞仪（FCM）检测CNE1细胞X射线照射前后的mdr1基因和P-gp的表达及对柔红霉素（daunorubicin,DNR）的外排功能。结果  鼻咽癌CNE1细胞射线照射前mdr1基因、P-gp不表达；射线照射后较长时间内mdr1基因、P-gp均长时间表达。CNE1细胞射线照射后对DNR的蓄积作用略有降低。结论  鼻咽癌CNE1细胞X射线照射后化疗敏感性降低。    　　［关键词］  鼻咽肿瘤；肿瘤细胞，培养的；基因，mdr1；P-糖蛋白；放射治疗；化疗敏感性    　　The change of chemotherapy sensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell after radiotherapy

　　BU Jun-guo,XIAO Ming-xing.

　　Department of Radiotherapy,Oncology Center,Zhujiang Hospital,The Southern Medical University,Guangzhou 510282,China

　　［Abstract］  Objective  To examine the expression of multidrug resistance gene(mdr1) and P-glycoprotein(P-gp) in nasopharyngeal carcinoma(NPC) CNE1 cell before and after radiotherapy,as well as the changes of chemotherapy sensitivity.Methods  The expression of mdr1 gene and its protein P-gp was assayed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting.Flow cytometry (FCM) was performed to examine the function of cell efflux to daunorubicin.Results  Expression of mdr1-mRNA and P-gp of CNE1 cell in long time after radiotherapy was found,but not before.Intracellular daunorubicin(DNR) accumulation of CNE1 cell decreased after radiotherapy.Conclusion  Irradiation decreases the chemotherapy sensitivity of CNE1 cell.

　　［Key words］  nasopharyngeal carcinoma;tumor cells,cultured;Genes mdr1;P-glycoprotein;radiotherapy;chemotherapy sensitivity    　　中晚期鼻咽癌的治疗原则为放疗、化疗综合治疗。按照化疗安排在放疗前、放疗同时和放疗后分为：诱导化疗、同步化疗和辅助化疗，目前上述各种匹配方法临床上都有应用。以前往往着眼于化疗后的MDR，但在射线照射后mdr1及P-gp的表达和功能尤其在鼻咽癌细胞及其基础研究较少。多药耐药基因（mdr1基因）扩增及其编码产物P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的过度表达是目前已发现的最重要的一种多药耐药（multidrug resistance，MDR）机制，大多数肿瘤MDR的发生被认为与mdr1有关。我们所说的MDR一般是指由化疗引起的，但放疗是否会引起MDR呢？本研究观察体外培养的鼻咽癌CNE1细胞X线照射前后mdr1基因和P-gp的表达和功能的变化。

　　1  材料与方法

　　1.1  细胞和材料  鼻咽癌细胞系CNE1(中山大学肿瘤研究所)，小牛血清（杭州四季青公司），RPMI1640基础培养基（Invitrogen公司），二甲基亚砜（DMSO）（广州化学试剂厂），PBS（博士德生物有限公司），柔红霉素（意大利Pharmacia & Upjohn S.p.A），P-gp单克隆抗体C219（Calbiochem-Novabiochem公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（二抗）（晶美公司），DNA Marker（华美生物工程公司），低融点琼脂糖（Promega公司，华美生物工程公司分装），Taq Plus Ⅱ DNA聚合酶(Sangon公司)、PCR扩增缓冲液和dNTP（华美生物工程公司），各种限制性内切酶、连接酶等（Promega、Gibco、Clontech等公司），Trizol试剂盒（Invitrogen公司），mdr1基因及内参照基因三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）PCR引物由上海生工公司合成，P-gp阳性对照来自第四军医大学消化研究所胃癌多药耐药细胞系HT70细胞裂解液。

　　1.2  细胞培养  用含10%小牛血清及1%双抗的RPMI1640培养基常规37.0 ℃、5% CO2培养箱中培养，0.25%胰酶消化、传代。射线照射后继续培养两周后，每隔4天消化一次细胞冻存用于RT-PCR检测和Western blotting分析。

　　1.3  射线照射  取指数生长期细胞进行射线照射。照射源：美国VARIAN 2300 C/D型双光子直线加速器；照射条件：应用X射线，剂量率200 cGy/min,照射剂量：4 Gy;照射野大小：15 cm×15 cm。照射前有物理室测量照射剂量率，并对培养皿进行衰减校正。把培养皿置于照射野中心。

　　1.4  RT-PCR检测  参照文献［1］方法。

　　1.5  Western blotting分析  亦参照文献［1］方法。

　　1.6  流式细胞仪检测  待细胞长满单层用于流式细胞仪检测：（1）取未经X射线照射的CNE1细胞作为阴性对照，以排除细胞自身发光；（2）分取未经X射线照射、经X射线照射4Gy后经2次传代的CNE1细胞，加入可自发红色荧光的柔红霉素［2］,使培养基中柔红霉素终浓度达2 μmol/L。经X射线照射，加入柔红霉素的CNE1细胞，作为阳性对照（3）2 h后0.25%胰酶消化收获细胞，冷PBS(0 ℃)吹洗、离心3次后，用500 μl冷PBS吹散细胞；（4）在流式细胞仪上检测（激发光源波长488 nm,滤过光源波长575 nm）。每个标本检测的细胞数超过10000个。

　　2  结果

　　2.1  RT-PCR结果  CNE1细胞X射线照射前均未观察到mdr1 mRNA的表达；X射线照射后mdr1 mRNA均长时间稳定表达（见图1）。

　　2.2  Western blotting 结果  CNE1细胞X射线照射前均未观察到P-gp的表达； X射线照射后P-gp基本上均长时间明显表达（见图2）。

　　2.3   FCM结果  FCM检测到：射线照射后CNE1的阳性细胞数不变，但细胞内的DNR平均荧光度略有降低。说明：CNE1细胞射线照射后对DNR的敏感性略有降低（见图3、4）。1:射线照射前的CNE1细胞;6:DNA Marker;2～5,7～10:射线照射后每4天的CNE1细胞

　　图1－图2  略

　　3   讨论    　　多药耐药是肿瘤化疗失败的主要原因之一，是指肿瘤细胞先天存在或经化疗药物治疗后，表现出不仅对所用化疗药物产生耐药性，而且对许多结构无关和作用机制完全不同的其他抗癌药物产生耐药性。1976年Juliano与Ling首先观察到具有MDR 表型的CHO细胞内药物积聚发生障碍,分子量为170 kD 的膜糖蛋白-P糖蛋白过度表达。该细胞摄入药物与敏感细胞没有差异，但药物外排能力却加强，表明P-gp能调节细胞膜通透性,影响药物在细胞内积聚［3］随后一系列研究证明MDR细胞抗药程度及胞内药物积聚与P-gp过度表达有关［4，5］ 。P-gp是由mdr1基因编码、由1280个氨基酸残基组成、分子量为170 kD的跨膜蛋白。在肿瘤细胞中，

图3 －图4  略

　　P-gp通过ATP供能，将长春新碱、秋水仙素、放线菌素D等药物泵出细胞外导致肿瘤细胞耐药。现已证实编码人P-gp的基因（mdr1）位于第7号染色体7q21，含28个外显子，全长为4.5 Kb。    　　中晚期鼻咽癌的治疗一般采取放疗、化疗综合治疗的原则。按照化疗安排在放疗前、放疗同时和放疗后分为：诱导化疗、同步化疗和辅助化疗，目前上述各种匹配方法临床上都有应用。以前往往着眼于化疗后的MDR，但在射线照射后mdr1及P-gp的表达尤其在鼻咽癌细胞及其基础研究较少。在其他肿瘤方面，Nielsen D等［7］报道：鼠Ehrlich腹水肿瘤细胞(EHR2)体外分次照射后获得MDR 表型， P-gp表达水平升高［6］。Osmak M等报道：人宫颈癌细胞（HeLa）射线照射后对长春新碱抵抗，并认为与P-gp有关。Hill BT等［8］用中国仓鼠卵巢肿瘤细胞(CHO)、 人卵巢癌细胞经X线照射均获得MDR 表型，P-gp过度表达。来自临床的研究也报道放疗后残存的口腔癌组织P-gp表达明显上调［9］。    　　放射线是否可诱发多药耐药，目前结论尚不一致。Hill、Mattern、Thacker［10，11］等的实验研究支持分次或单次放射可增强mdr1mRNA的表达，提示可诱发多药耐药倾向。但Sanchez等［12］采用2Gy×7次和2Gy×14次的照射方式，可降低耐药基因的表达，提高对化疗药物的敏感性。虽然在耐药细胞系中，有mdr1基因扩增，但大多数研究认为，人体内P-gp的高表达并不是mdr1基因扩增的结果，而是mdr1基因转录翻译的产物［13］。因此，研究MDR多在mRNA和蛋白质水平，本实验应用敏感性高的RT-PCR与Western blotting方法检测到鼻咽高分化鳞癌细胞CNE1射线照射后较长时间内mdr1基因、P-gp均明显表达，提示射线照射后鼻咽癌细胞可能产生多药耐药倾向。当然，在体内的实际情况都需进一步验证。

　　［参考文献］

　　1  卜俊,袁亚维,陈俊.X射线照射后鼻咽癌细胞多药耐药基因的表达.第一军医大学学报,2004,24(6):646-649.

　　2  平宝红,周淑芸,刘启发,等.4种细胞因子对K56/S及其耐药细胞株K562/A02积蓄柔红霉素的影响.第一军医大学学报,2000,20(2):158-160.

　　3  Juliano RL，Ling V.A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants.Biochem Biophys Acta,1976,455(1):152-162.

　　4  Lehne G,Elonen E,Baekelandt M,et al.Challenging drug resistance in cancer  therapy.Acta Oncol,1998,37(5):431-439.

　　5  袁亚维,张积仁,周殿元.乳腺癌mdr1基因表达调控的探讨.第一军医大学学报，1999,19(5):408-410.

　　6   Nielsen D,Maare C,Eriksen J,et al.Expression of P-glycoprotein and multidrug resistance associated protein in Ehrlich ascites tumor cells after fractionated irradiation.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2001,51(4):1050-1057.

　　7  Osmak M,Miljanic S,Kapitanovic S.Low doses of gamma-rays can induce the expression of mdr gene.Mutat Res,1994,324(1-2):35-41.

　　8  Hill BT,Moran E,Etievant C,et al.Low-dose twice-daily fractionated X-irradiation of ovarian tumor cells in vitro generates drug-resistant cellsoverexpressing two multidrug resistance-associated proteins,P-glycoproteinand MRP1.Anticancer-Drugs,2000,11(3):193-200.

　　9   Ng IO,Lam KY,Ng M,et al.Expression of P-glycoprotein, a multidrug-resistance gene product, is inducedby radiotherapy in patients with oral squamous cell carcinoma.Cancer,1998,83(5):851-857.

　　10  Hill BT,Deuchars K,Hosking LK,et al.Overexpression of P-glycoprotein in mammalian tumor cell lines after fractionated X irradiation in vitro.J Natl Cancer Inst,1990,82:607-612.

　　11  Mattern J,Efferth T,Volm M.Overexpression of P-glycoprotein in human lung carcinoma xenografts after fractionated irradiation in vivo.Radiat Res,1991,127(3):335-338.

　　12  Sanchez AM,Barrett JT,Schoenlein PV.Fractionated ionizing radiation accelerates loss of amplified MDR1 genes harbored by extrachromosomal DNA in tumor cells.Cancer Res,1998,58:3845-3854.

　　13  Lemontt JF,Azzaria M,Gros P.Increased mdr gene expression and decreased drug accumulation in multidrug-resistant human melanoma cells.Cancer Res,1988,48:6348-6353.

　　作者单位： 510282 广东广州，南方医科大学珠江医院肿瘤中心放疗科