下咽鳞癌Ets1、磷酸化STAT3的表达及其与侵袭转移的关系

　　作者：步明强,徐伟,吕正华,李会政　　作者单位：山东大学附属省立医院耳鼻咽喉-头颈外科， 济南 250021

　　【摘要】目的 检测转录因子Ets1和磷酸化信号转导和转录活化因子3(PSTAT3)在下咽癌原发灶及其颈淋巴结转移灶的表达，并探讨其与下咽癌侵袭转移的关系。方法 应用免疫组织化学SP法检测52例单纯手术患者下咽癌原发灶及相应36例颈淋巴结转移灶中Ets1、PSTAT3蛋白的表达。结果 在52例下咽癌原发灶中，Ets1、PSTAT3蛋白的表达率分别为61.54%(32/52)和75.00%(39/52);Ets1、PSTAT3蛋白在T3～T4级下咽癌原发灶的表达率均显著高于T1～T2级(P<0.05，P<0.01);在有颈淋巴结转移下咽癌原发灶的表达率均显著高于无淋巴结转移者(均P<0.05);Ets1蛋白在有肺转移下咽癌原发灶的表达率显著高于无肺转移者(P<0.05);在36例有颈淋巴结转移下咽癌中，Ets1、PSTAT3蛋白在转移灶的表达率分别为52.78%(19/36)和58.33%(21/36);原发灶PSTAT3蛋白表达率显著高于转移灶(P<0.01)。结论 Ets1和PSTAT3蛋白在下咽癌中均高表达，并与肿瘤T分级、颈淋巴结转移密切相关，Ets1表达还与肺转移有关。Ets1和PSTAT3有可能成为临床判断下咽癌侵袭性、转移潜能的有效指标。

　　【关键词】 下咽肿瘤;鳞状细胞癌;Ets1;磷酸化信号转导和转录活化因子3;侵袭;转移

　　BU Mingqiang, XU Wei， L Zhenghua, LI Huizheng

　　(Department of Otorhinolaryngology & Head and Neck Surgery, Provincial Hospital Affiliated to

　　Shandong University, Jinan 250021, China)

　　To explore expressions of transcription factor Ets1 and phosphorylatedsignal transducers and activators of transcription 3(PSTAT3) in hypopharyngeal primary carcinoma and metastatic cervical lymph nodes and to study their correlation with invasion and metastasis of hypopharyngeal carcinoma. Methods Immunohistochemical staining was adopted to determine expressions of Ets1 and PSTAT3 protein in 52 cases who had radical resection of hypopharyngeal carcinoma and matched 36 metastatic lymph nodes. Results In 52 cases of hypopharyngeal carcinoma, expression rates of Ets1 and PSTAT3 protein were 61.54%(32/52) and 75.00%(39/52). The positive rates of Ets1 and PSTAT3 in T3 and T4 classification were significantly higher than those in T1 and T2 classification(P<0.05，P<0.01). The positive rates of Ets1 and PSTAT3 in metastatic lymph nodes were significantly higher than those in nonmetastatic lymph nodes(P<0.05). The positive rate of Ets1 in metastatic lung tissues was significantly higher than that in nonmetastatic lung tissues (P<0.05). In 36 cases of hypopharyngeal carcinoma with metastatic lymph nodes, expression rates of Ets1 and PSTAT3 protein in metastatic lymph nodes were 47.22% (17/36)　and 58.33% (21/36). The positive rate of PSTAT3 in primary carcinoma was significantly higher than that in metastatic lymph nodes(P<0.01). Conclusion Ets1 and PSTAT3 are overexpressed in hypopharyngeal carcinoma and are closely related to the T classification and cervical lymph node metastasis, expression of Ets1 is also significantly related to lung metastasis. Ets1

　　转录因子在肿瘤侵袭转移相关基因的表达调控中起着至关重要的作用，并已证明许多细胞癌基因就是具有启动子特异性的转录因子。近年来，文献报道转录因子类癌基因Ets1、磷酸化信号转导和转录活化因子3(PSTAT3)的表达与肿瘤侵袭转移密切相关[14]，我们用免疫组织化学方法检测Ets1、PSTAT3蛋白在下咽癌原发灶及其颈淋巴结转移灶的表达情况，以探讨二者在下咽癌的表达及与下咽癌侵袭转移的关系，为下咽癌的区域治疗和远处转移的早期干预治疗提供指导。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本 2004年3月～2006年6月山东大学附属省立医院耳鼻咽喉-头颈外科手术切除的下咽鳞癌石蜡标本52例，男49例,女3例; 44～81岁,中位年龄63岁;其中高、中、低分化鳞癌分别为9、33、10例;肿瘤TNM分期(UICC,2002)T1、T2、T3、T4级分别为2、7、16、27例;颈淋巴结转移36例;随访时间均在2年以上，发现肺转移8例(与术前CT对照)。患者术前均未接受放疗或化疗。

　　1.1.2 试剂 兔抗人Ets1单克隆抗体(ABSUN公司，美国)，兔抗人PSTAT3单克隆抗体(ABSUN公司，美国),SP试剂盒，3, 3′二氨基联苯胺( diamionben zidene, DAB)显色试剂盒。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组织化学染色 标本均经10%甲醛固定,石蜡包埋, 制成4μm厚的切片,置于64℃烤箱内30min, 常规脱蜡至水, 枸橼酸盐缓冲液抗原修复。免疫组化染色参照SP试剂盒操作说明进行, 其中一抗Ets1工作液浓度为1∶75, PSTAT3工作液浓度为1∶50，DAB显色后,苏木素复染、脱水、透明、封片,显微镜下观察, 以磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作阴性对照, 以试剂公司提供的阳性片作阳性对照。

　　1.2.2 结果判定 根据免疫组化染色结果,在双盲情况下，每张切片随机选择5个高倍镜视野(×400)分析,每个视野至少计数100个肿瘤细胞,对染色阳性细胞进行计数。Ets1阳性细胞为细胞浆和(或)细胞核中出现棕黄色颗粒(图1，2)。根据阳性细胞百分率分为4级: 阳性细胞数<10%为阴性(-);10%～30%为弱阳性(+);30%～50%为阳性(+图 1 Ets1蛋白在下咽癌原发灶的阳性表达(SP×400)Ets1蛋白在下咽癌颈淋巴结转移灶的

　　2 结 果

　　2.1 下咽癌T分级、颈淋巴结转移、肺转移间的关系 T3～T4级颈淋巴结转移率为79.07%(34/43)，显著高于T1～T2级[44.44%(4/9)](P=0.034); T3～T4级术后肺转移率为18.60%(8/43)，高于T1～T2级(术后无肺转移 0/9)，但差异无统计学意义(P=0.166);颈淋巴结转移者术后肺转移发生率为22.22%(8/36)，显著高于无颈淋巴结转移者(术后无肺转移 0/16)(P=0.041)。

　　2.2 Ets1、PSTAT3表达 在52例下咽癌中，Ets1、PSTAT3蛋白在原发灶中表达率分别为61.54%(32/52)和75.00%(39/52)。在其中的36例颈淋巴结转移病例中，原发灶PSTAT3蛋白表达率显著高于转移灶;原发灶Ets1蛋白表达率高于转移灶，但差异无统计学意义(表1)。

　　2.3 下咽癌原发灶中Ets1和PSTAT3蛋白表达与T分级、颈淋巴结转移、远处肺转移的关系 见表2。 Ets1、PSTAT3蛋白在T3～T4级下咽癌原发灶的表达率显著高于T1～T2级;Ets1、PSTAT3蛋白在颈淋巴结转移下咽癌原发灶的表达率显著高于无淋巴结转移者;Ets1蛋白在术后肺转移下咽癌原发灶的表达率显著高于无肺转移者;PSTAT3蛋白在术后肺转移下咽癌原发灶的表达率高于无肺转移者，但差异无统计学意义。 表1 36例颈淋巴结转移下咽癌的原发灶和转移灶中Ets1和PSTAT3蛋白的表达

　　3 讨 论

　　下咽癌是头颈肿瘤中预后较差的肿瘤，多呈浸润性生长，易发生转移。而侵袭转移是影响肿瘤临床疗效和预后的重要因素，了解肿瘤侵袭转移的机制和特点，可有效判断个体肿瘤的预后，并为个体肿瘤的控制转移和进一步干预治疗提供依据。文献报道原发癌T分级是头颈肿瘤颈淋巴结转移和远处转移的重要影响因素[78]。本研究发现，随着下咽癌T分级的升高，颈淋巴结转移率明显增高，有颈淋巴结转移者术后肺转移发生率显著增高，提示下咽癌T分级与颈淋巴结转移有关，颈淋巴结转移与术后肺转移有关，下咽癌的转移是一个多阶段、多步骤、逐步进展的过程。此外，本研究中T3～T4级术后肺转移发生率较T1～T2级增高，由于例数较少，差异无统计学意义，但提示随着下咽癌原发灶的不断进展，术后肺转移发生率有增高的趋势，这与李晓明等[8]的报道相似。

　　Ets1是Ets癌基因家族的起源基因,主要通过转录调节发挥作用。Ets1蛋白可上调基质金属蛋白酶(MMP)1、3、9, 尿激酶型血浆酶原激活因子(uPA)和整合素β3等蛋白的表达, 从而分解细胞外基质及基底膜, 降低肿瘤细胞粘着性,并参与肿瘤血管形成,促使肿瘤侵袭转移。Sato等[1]报道了原发性结直肠癌中Ets1表达与肺转移独立相关。Pande等[23]研究发现，Ets1在口腔鳞癌的表达与肿瘤T分级、颈淋巴结转移密切相关，还进一步报道了Ets1与远处转移明显相关。本研究中Ets1蛋白在下咽癌原发灶中表达率为61.54%，在肿瘤T分级较高(T3+T4)、有颈淋巴结转移、术后肺转移的下咽癌原发灶中表达率高，提示Ets1表达与下咽癌T分级、颈淋巴结转移、术后肺转移有关，可能在下咽癌侵袭、转移中起促进作用，有可能成为判定下咽癌侵袭性、预测转移的有效指标，有利于发现隐匿性颈淋巴结转移和术后肺转移。

　　磷酸化STAT3(PSTAT3)是STAT3的活化形式，活化的STAT3可对多种参与细胞生长和生存基因的表达进行调控，一旦STAT3活化失控, 即可能通过多种途径导致细胞增殖失控和恶性转化，还可以诱导VEGF和MMP2的表达，促进肿瘤血管生成。Kusaba等[4]报道了结肠癌中PSTAT3的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期显著相关。本研究发现，PSTAT3蛋白在下咽癌原发灶中表达率为75.00%，在肿瘤T分级较高(T3+T4)，有颈淋巴结转移的下咽癌原发灶中表达率高，提示PSTAT3表达与下咽癌侵袭转移能力有关，可能在下咽癌侵袭、转移中起重要作用。此外，Seethala等[9]报道了PSTAT3在头颈鳞状细胞癌和相应颈淋巴结转移灶的表达密切相关。本研究也发现，在颈淋巴结转移的下咽癌中，PSTAT3蛋白在原发灶的表达率明显高于转移灶，进一步提示PSTAT3可能在下咽癌侵袭、颈淋巴结转移中起重要作用，有可能成为预测下咽癌侵袭、颈淋巴结转移的一个指标，为探索治疗下咽癌侵袭转移提供理论依据。

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