老年性痴呆相关基因ｎｉｃａｓｔｒｉｎ启动子区单核苷酸多态性分析

作者：李中， 丘东海， 刘红英， 方莹莹   

作者单位：中山大学附属第一医院神经科， 广东 广州 ５１００８０

【摘要】  【目的】 分析老年性痴呆（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病）相关基因ｎｉｃａｓｔｒｉｎ启动子区单核苷酸多态性（ＳＮＰ），探讨其基因表达可能的分子调控机制。【方法】 扩增ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因ＡＴＧ上游约１．０ ｋｐ启动子区ＤＮＡ片段，与萤火虫荧光素酶报告基因载体ｐＧＬ３-Ｂａｓｉｃ进行重组质粒的克隆与鉴定，确立启动子区候选功能ＳＮＰ及其相应位点结合的转录调节因子。应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００对包含功能ＳＮＰ的重组质粒进行ＣＲＬ-２１３７细胞瞬时转染，双荧光素酶相对活性分析及电泳迁移率变动分析。【结果】 Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因启动子区９６０ ｂｐ ＤＮＡ片段内存在功能ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ→Ｔ，与其相应位点结合的转录因子为ｈｅｐａｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｆａｃｔｏｒ（ＨＬＦ），ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｔ的序列结构对启动萤火虫荧光素酶报告基因的表达功能较ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ的序列结构强（Ｐ ＜ ０．０５， ｎ＝３）。 【结论】 Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因核心启动子应该在９６０ ｂｐ ＤＮＡ片段内，ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ→Ｔ可能是启动子区有功能位点突变，包含ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ／Ｔ的核苷酸序列结构可能通过与ＨＬＦ在内的转录调节因子的作用来实现对ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因表达差异的调控。

【关键词】  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病；Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ；启动子；单核苷酸多态性；电泳迁移率变动分析

    Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ

    ｗｉｔｈ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ

    ＬＩ Ｚｈｏｎｇ， ＱＩＵ Ｄｏｎｇ-ｈａｉ， ＬＩＵ Ｈｏｎｇ-ｙｉｎｇ， ＦＡＮＧ Ｙｉｎｇ-ｙｉｎｇ

    （ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８０， Ｃｈｉｎａ ）

    Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （ＳＮＰ） ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ （ＡＤ） ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ａｎ ａｂｏｕｔ １．０ ｋｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ ＡＴＧ ｏｆ ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｆｉｒｓｔｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｂｙ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ ｐＧＬ３-Ｂａｓｉｃ ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ． Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ＳＮＰ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ （ＴＦＢＳ） ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｗｅｒｅ ｄｅｆｉｎｉｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ＳＮＰ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ ｉｎ ＣＲＬ-２１３７ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｕｓｅｄ ｂｙ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００． Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ （ＲＬＡ） ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ （ＥＭＳＡ） ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ．  【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ→Ｔ ｉｎ ９６０ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ， ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ＴＦＢＳ ｗａｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｆａｃｔｏｒ （ＨＬＦ）． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｔ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ （Ｐ ＜ ０．０５，ｎ＝３）． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】 Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｇｅｎｅ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｗｉｔｈｉｎ ９６０ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ ｔｏ Ｔ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ／Ｔ ｍｉｇｈｔ ｃａｒｒｙ ｏｕｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｂｙ ｗａｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｏｍｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＨＬＦ．

  Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ； ｎｉｃａｓｔｒｉｎ； ｐｒｏｍｏｔｅｒ； ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ； ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ

    老年性痴呆又称Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ， ＡＤ），是一种以进行性记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统退行性变性疾病。随着社会经济的发展，人类寿命普遍延长，ＡＤ发病率呈逐年上升趋势，但是，ＡＤ 的病因学和发病机制至今尚不明了，亦无有效治疗方法。研究发现，β淀粉样蛋白（ｂｅｔａ-Ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， Ａβ）沉积（老年斑形成）是ＡＤ脑神经细胞主要变性区域的核心病理特征之一，并能导致其他病理结构的出现［１，２］。Ａβ来源于脑内γ分泌酶（ｇａｍｍａ-ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）对Ⅰ型跨膜蛋白ＡＰＰ（ｂｅｔａ-Ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）跨膜区的切割。γ分泌酶是一种大分子质量多蛋白复合体， 由Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ-１、 Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ、 ＡＰＨ-１和ＰＥＮ-２四种蛋白组成，缺一不可，相互起着稳定因子的作用，其中任一种蛋白表达水平的变化将直接影响其他蛋白的稳定性、水解成熟、糖基化或向细胞表面的运输，进而影响γ分泌酶的活性，产生难以消除的不可溶性片断，导致Ａβ脑内沉积［３－６］。本文将从ＡＤ相关基因ｎｉｃａｓｔｒｉｎ启动子区研究入手，分析研究ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因启动子区单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ， ＳＮＰ）及其转录因子结合位点（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ， ＴＦＢＳ）情况，探讨ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因启动子区表达调控的分子机制，期望能为阐明该基因表达调控与γ分泌酶功能以及ＡＤ发病相关性提供新的线索和实验依据，为进一步揭示ＡＤ发病机制和为临床寻找防治ＡＤ新的药物及其他干预治疗手段打下基础。

    １   材料和方法

    １．１  材  料

    大肠杆菌感受态细胞和ＣＲＬ-２１３７细胞株（来源于人脑神经母细胞）为本室保存。ｐＧＬ３-Ｂａｓｉｃ和ｐＧＬ３-Ｃｏｎｔｒｏｌ萤火虫荧光素酶报告基因载体、ｐｈＬ-Ｒｅｎｉｌｌａ水母荧光素酶载体及双荧光素酶活性分析试剂盒均为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；ＰＣＲ反应、产物纯化以及质粒提取试剂盒均为ＱＩＡＧＥＮ公司产品；限制性内切酶ＫｐｎⅠ、ＨｉｎｄⅢ及Ｔ４ ＤＮＡ连接酶为Ｂｉｏｌａｂｓ公司产品；ＤＭＥＭ、Ｏｐｔｉ-ＭＥＭＩ细胞培养液和胎牛血清、合成引物及探针、脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００均为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；细胞核蛋白抽提及电泳迁移率变动分析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ，ＥＭＳＡ）试剂盒为Ｎｏｖａｇｅｎ公司产品，同位素［γ-３２Ｐ］ＡＴＰ为Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司产品。

    １．２  Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因启动子的克隆与鉴定

    登陆ＧｅｎＢａｎｋ查询人类ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因组序列，通过美国国立生物技术信息网ＮＣＢＩ确定基因组ＤＮＡ 翻译起始点ＡＴＧ位置并结合文献确定ｎｉｃａｓｔｒｉｎ转录本大小及大致定位其启动子位置。结合ｐＧＬ３-Ｂａｓｉｃ报告基因载体多克隆酶切位点分析设计引物，Ｈｏｔｓｔａｒ ＤＮＡ 多聚酶扩增其ＡＴＧ上游约１．０ ｋｐ的ＤＮＡ片段并纯化，此扩增片段经凝胶电泳观察并测序验证。参照《分子克隆（第３版）》［７］相关技术指南， ｐＧＬ３-Ｂａｓｉｃ与上述ＤＮＡ扩增片段进行酶切、ＤＮＡ连接、感受态细胞转化、回收阳性克隆重组质粒并双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序验证。

 １．３  Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ启动子区功能ＳＮＰ的选择及其ＴＦＢＳ的确立

    针对上述启动子片段序列，登陆ｗｗｗ．ｓｎｐｐｅｒ．ｃｈｉｐ．ｏｒｇ和ｗｗｗ．ｐｕｐａｓｎｐ．ｏｒｇ 进行比对，推断ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因启动子区的候选功能ＳＮＰ并运用ｗｗｗ．ｇｅｎｅ-ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ｃｏｍ的ＭａｔｃｈＴＭ和ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ／ｍａｔｉｎｓｐｅｃｔｏｒ．ｈｔｍｌ的ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ ２．０数据库及程式，匹配出与候选功能ＳＮＰ相应位点结合的最可能的转录调节因子。

    １．４  瞬时转染及双荧光素酶活性分析

    ＣＲＬ-２１３７细胞在含１００ ｍＬ／Ｌ胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培养液及３７ ℃、体积分数５％ ＣＯ２和适合湿度的条件下传代培养。按产品说明书技术指南进行２４孔板脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００的瞬时转染。转染体系如下：每孔细胞数５ × １０４，脂质体与质粒ＤＮＡ质量比为２ ∶ １，待检及对照质粒与内对照ｐｈＬ-Ｒｅｎｉｌｌａ的质量比为１００ ∶ １，补充无抗生素及无血清Ｏｐｔｉ-ＭＥＭＩ培养液至总体积５０ μＬ；每个质粒至少单独转染３次。

    转染３０ ～ ３６ ｈ后收集细胞，参照Ｐｒｏｍｅｇａ公司试剂盒操作手册在荧光检测仪上进行相对荧光素酶活性（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ＲＬＡ）测定，每孔测２次求均值。机器对各孔细胞转染效率通过内对照活性进行自动校正，校正后的转染活性减去阴性对照值，再除以阳性对照值，最后得到各样品相对于阳性对照ＳＶ４０启动子的相对活性。对此相对活性数据进行单样品ｔ检验和单因素方差分析，并在此基础上进行均数间两两比较（α＝０．０５）。

    １．５  电泳迁移率变动分析

    设计合成包含ｎｉｃａｓｔｒｉｎ启动子区候选功能ＳＮＰ及其相应转录调节因子结合位点ＴＦＢＳ在内的约２０ ｂｐ大小的核苷酸序列作为探针，并在其５′-末端用同位素［γ-３２Ｐ］ ＡＴＰ标记， ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔＴＭ Ｇ-５０过柱纯化后于－２０ ℃保存备用。按核蛋白抽提试剂盒说明书抽提ＣＲＬ-２１３７细胞核蛋白，并进行Ｂｉｏ-Ｒａｄ蛋白质量检测。按以下程序进行ＤＮＡ-蛋白结合反应：① 阴性对照反应（仅有标记探针）；② 阳性反应（核蛋白＋标记的已知探针）；③ 探针冷竞争反应（核蛋白＋标记探针＋１０倍标记探针量的同源未标记探针）；④ 突变探针的冷竞争反应（核蛋白 ＋ 标记探针 ＋ １０倍标记探针量的未标记ＳＮＰ突变探针）；⑤ 突变探针的冷竞争反应（核蛋白＋标记突变探针＋１０倍标记突变探针量的未标记探针）。反应样品于质量浓度６％聚丙烯酰胺凝胶电泳，干胶后Ｘ线片压片并进行放射自显影检测。

    ２   结   果

    ２．１  Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因启动子重组质粒的克隆与鉴定

    根据载体多克隆酶切位点，确定ＫｐｎⅠ和ＨｉｎｄⅢ两个酶切位点，运用ＯＬＩＧＯ ｐｒｉｍｅｒ３程序设计上下游引物分别为５′-ａｔｇｇｔａｃｃＧＡＴＣＴＣＡＧＴＡＴＴ ＴＧＣＣＣＴＣＣＡ-３′ （ｆｏｒｗａｒｄ）和５′-ａｔａａｇｃｔｔＧＧＡＧＣＣＴ ＡＡＧＡＧＡＣＣＧＧＡＡＧ-３′ （ｒｅｖｅｒｓｅ），Ｈｏｔｓｔａｒ ＤＮＡ 多聚酶扩增出９６０ ｂｐ大小的ＤＮＡ片段，此扩增片段和阳性克隆重组质粒及其双酶切后经质量浓度１．２％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图１，产物均经测序验证正确。

    ２．２  ＲＬＡ分析与ＥＭＳＡ

  经比对，推断出ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ→Ｔ为ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因启动子区的候选功能ＳＮＰ并匹配出与其相应位点结合的最可能的转录调节因子为ｈｅｐａｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｆａｃｔｏｒ（ＨＬＦ， ａｔｔｔｃｃａｇａｔ， 下划线结构为ＴＦＢＳ）。采用带ＳＶ４０启动子与增强子的ｐＧＬ３-Ｃｏｎｔｒｏｌ萤火虫荧光素酶报告基因载体作为阳性对照，未连接克隆片段的空ｐＧＬ３-Ｂａｓｉｃ作为阴性对照，ｐｈＬ-Ｒｅｎｉｌｌａ水母荧光素酶载体作为每个转染的内对照（用于校正背景值），由此构成双荧光素酶活性分析系统，其结果如图２（两两比较有统计学意义，Ｐ ＜ ０．０５，ｎ＝３），提示ｎｉｃａｓｔｒｉｎ启动子区包含ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｔ的序列结构对启动萤火虫荧光素酶报告基因的表达功能较包含ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ的序列结构要强。进一步的ＥＭＳＡ分析结果也显示ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｔ的核苷酸序列结构能与核蛋白中的转录调节因子ＨＬＦ 结合并成为凝胶电泳迁移时相对独立的泳动带（图３ Ｌａｎｅ ４）。

    ３   讨   论

    自２０００年ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因被克隆伊始，就发现它可与其他３种蛋白相互作用形成γ分泌酶，并对ＡＤ脑的病理结构形成起重要作用［８，９］。Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ属Ⅰ型跨膜糖蛋白，它可能作为γ分泌酶的底物结合位点参与酶与底物的选择性结合；因此，ｎｉｃａｓｔｒｉｎ 表达的差异对γ分泌酶的功能具有一定的调节作用［１０，１１］。

    Ｓａｔｏｈ等［１２］研究发现，在人类神经元细胞系中ｎｉｃａｓｔｒｉｎ 对早老素功能起着关键的调节作用。Ｄｅｒｍａｕｔ等［１３］报道了荷兰人家族早发性ＡＤ与ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因内含子多态性相关。Ｌｉ等［１４］对ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因缺陷小鼠胚胎研究认为，ｎｉｃａｓｔｒｉｎ是γ分泌酶的重要组件，在介导Ｎｏｔｃｈ信号通路和哺乳动物细胞ＡＰＰ的加工与运输中不可缺少。Ｃｏｎｆａｌｏｎｉ等［１５］对意大利家族性和散发性ＡＤ病人ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因突变研究发现有相关性。

    γ分泌酶的功能不正常可以造成Ａβ的脑内异常沉积，从而产生ＡＤ脑的病理结构变化；因此，作为γ分泌酶重要组件之一的ｎｉｃａｓｔｒｉｎ有可能与ＡＤ的发生发展有着密切的相关性。那么在分子水平上，ｎｉｃａｓｔｒｉｎ的表达调控如何？它的表达调控差异是否与ＡＤ发病有关？该问题的解答将为揭示ＡＤ的发病机制与创立ＡＤ新的治疗途径提供依据。

    本文通过生物信息学技术，推断出人ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因启动子区９６０ ｂｐ大小的ＤＮＡ片段内存在候选功能ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ→Ｔ及与其相应位点结合的最可能的转录因子ＨＬＦ。在此基础上运用基因重组分子克隆与基因表达技术，发现了包含ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｔ序列结构对启动萤火虫荧光素酶报告基因的表达功能较包含ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ的相对要强；而且ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｔ的核苷酸序列结构能与来源于人脑神经母细胞瘤的ＣＲＬ-２１３７细胞系核蛋白中的转录调节因子ＨＬＦ结合；提示ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因核心启动子应该在扩增的９６０ ｂｐ大小的ＤＮＡ片段内，ＳＮＰ＿ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ→Ｔ 可能是启动子区有功能位点突变，而包含ｒｓ１０７５２６３７ -９２２ Ｇ／Ｔ的核苷酸序列结构可能通过与包括ＨＬＦ在内的转录调节因子的作用来实现对ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因表达差异的调控。

    杨眉等［１６］研究认为，ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因启动子很可能位于翻译起始位点上游-４３２／-１３３处，与本研究的位点不同。笔者认为，由于受质粒构建以及存在组织表达差异的影响，仅从启动子区截断片段对报告基因表达强度的差异而不验证其在转录水平与转录调控因子作用的大小，是不能真正说明其是否为有功能的启动子核心片段的。Ｏｒｌａｃｃｈｉｏ等［１７］对ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因启动子区位于-７９６ Ｔ／Ｇ和   -１２１６ Ｃ／Ａ两个ＳＮＰｓ的研究表明与家族性ＡＤ及其发病年龄均无相关性。笔者认为，ｎｉｃａｓｔｒｉｎ是ＡＤ发病关键因素γ分泌酶的重要组件之一，ｎｉｃａｓｔｒｉｎ基因启动子区单核苷酸多态性从一定程度上说明了ＡＤ发病多基因遗传的复杂性，提示我们今后的研究工作应多着眼于分子转录水平的功能表达以及蛋白的结构功能上，而不仅仅是研究基因的结构差异。

 （感谢香港大学医学院基因研究中心宋又强博士在分子克隆及生物信息学领域的技术支持与帮助）

【参考文献】  杨志勇，汪华侨，张 革，等． 国人外周血抗?茁-淀粉样蛋白抗体水平的依龄性变化 ［Ｊ］． 中山大学学报：医学科学版， ２００５，２６（２）：１２５-１２８．

陈 辉，张太松，范海虹，等． 阿尔茨海默病患者外周血ＡＰＰ ｍＲＮＡ水平的变化 ［Ｊ］． 中华神经医学杂志， ２００６，５（４）：３２５-３２８，３４１．

Ｖｅｒｄｉｌｅ Ｇ， Ｇａｎｄｙ ＳＥ， Ｍａｒｔｉｎｓ ＲＮ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｂｅｔａ ａｍｙｌｏｉｄ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ， ２００７，３２（４-５）：６０９-６２３．

Ｓｈｉｒｏｔａｎｉ Ｋ， Ｔｏｍｉｏｋａ Ｍ， Ｋｒｅｍｍｅｒ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ｃａｎ ｂｅ ｅｘｅｃｕｔｅｄ ｂｙ ｓｉｘ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇａｍｍａ-ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ， ２００７，２７（１）：１０２-１０７．

Ｐａｒｄｏｓｓｉ-ｐｉｑｕａｒｄ Ｒ， Ｄｕｎｙｓ Ｊ， Ｙｕ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ［Ｊ］． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ， ２００６，９７（４）：１０５２-１０５６．

Ｓｔ Ｇｅｏｒｇｅ-ｈｙｓｌｏｐ Ｐ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ， ２０００，７（５）：５４６-５４８．

Ｊｏｓｅｐｈ Ｓ， Ｄａｖｉｄ Ｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ［Ｍ］． ３ｒｄ ｅｄ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１．

Ｒｏｚｍａｈｅｌ Ｒ， Ｍｏｕｎｔ ＨＴ， Ｃｈｅｎ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ａｌｌｅｌｅｓ ａｔ ｔｈｅ Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｌｏｃｕｓ ｍｏｄｉｆｙ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ-１ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２００２，９９（２２）：１４４５２-１４４５７．

Ｙｕ Ｇ， Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｍ， Ａｒａｗａｋａ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｏｔｃｈ／ｇｌｐ-１ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｔａ-ＡＰＰ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ， ２０００，４０７（６８００）：４８-５４．

Ｃｈｅｎ Ｆ， Ｙｕ Ｇ， Ａｒａｗａｋａ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ-ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｎｏｔｃｈ ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ２００１，３（８）：７５１-７５４．

Ｓａｔｏｈ Ｊ， Ｋｕｒｏｄａ Ｙ． Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ， ａ ｋｅｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２００１，２１（２）：１１５-１２２．

Ｅｄｂａｕｅｒ Ｄ， Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｅ， Ｈａａｓｓ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ａｎｄ ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ-ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２００２，９９（１３）：８６６６-８６７１．

Ｍｕｒｐｈｙ ＭＰ， Ｄａｓ Ｐ， Ｎｙｂｏｒｇ ＡＣ， ｅｔ ａｌ． Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ａｂｅｔａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ［Ｊ］． ＦＡＳＥＢ Ｊ， ２００３，１７（９）：１１３８-１１４０．

Ｘｉａ Ｗ， Ｗｏｌｆｅ ＭＳ． Ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｂｙ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ-ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ［Ｊ］． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ， ２００３，１１６（Ｐｔ １４）：２８３９-２８４４．

Ｃｏｎｆａｌｏｎｉ Ａ， Ｔｅｒｒｅｎｉ Ｌ， Ｐｉｓｃｏｐｏ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｎｄ ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ， ２００３，３５３（１）：６１-６５．

杨 眉，蔡 芳，王瑞山，等． 阿尔兹海默病相关基因ｎｉｃａｓｔｒｉｎ启动子的克隆和鉴定 ［Ｊ］． 中南大学学报：医学版， ２００６，３１（１）：９-１３．

Ｏｒｌａｃｃｈｉｏ Ａ， Ｋａｗａｒａｉ Ｔ， Ｐｏｌｉｄｏｒｏ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｌａｃｋ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｃａｓｔｒｉｎ ｇｅｎｅ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ， ２００４，３６３（１）：４９-５３．