Cycin D1在鼻腔鼻窦肿瘤中的表达

　　作者：韩敏　　作者单位：青岛大学医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科， 山东 青岛 266003

　　【摘要】探讨cycin D1在鼻腔鼻窦肿瘤中的表达及其临床意义。方法：采用免疫组化SABC法检测20例鼻腔鼻窦恶性肿瘤和10例相应部位良性病变的石蜡标本中cycin D1的表达。结果：鼻腔鼻窦肿瘤中cycin D1表达均为阳性，良性病变中为阴性或弱阳性。鼻腔鼻窦恶性肿瘤中cycin D1积分与患者年龄、性别、病变部位及病理类型无关(P>0.05)。Cycin D1积分与TNM分期、病理分级相关(P<0.05 )，且积分随肿瘤临床分期、分级逐渐升高。初诊病例与复发病例之间cyclin D1积分差异有统计学意义(P<0.05 )。结论：Cycin D1在鼻腔鼻窦肿瘤的发生、发展及复发转移等临床病理过程中起重要作用。

　　【关键词】 Cyclin D1 鼻窦肿瘤 免疫组织化学

　　A[ABSTRACT] Objective: To investigate the expression of cyclin D1 in nasal sinus neoplasm and its clinical significance. Method: SABC immunohistochemical technique was used to determine the expression of cyclin D1 in 20 samples of nasal sinus carcinoma and 10 samples of benign lesion. Results: Cyclin D1 was overexpressed in all nasal sinus carcinoma, whereas no or weak expression was determined in benign lesions. The cyclin D1 integral was not correlated with age, gender, site of tumor or pathologic type(P>0.05) but correlated with the TNM stage and histological grade(P<0.05). Moreover, it gradually increased following the increase of stage and histological grade. There were significances between cyclin D1 integral of preliminary cases and recurrence cases(P<0.05). Conclusion: Cyclin D1 may play an important role in tumor genesis.

　　[KEY WORDS] Cyclin D1; Nasal sinus neoplasm; Immunohistochemisty 细胞周期是细胞生命活动的基本过程。在恶性肿瘤发生中，各种致瘤因素最终将影响细胞周期，导致细胞生长、分化失控。在多种与恶性肿瘤演进有关的细胞周期调节因子中cyclin D1备受瞩目。在多种人类肿瘤中，发现有cyclin D1基因的扩增。最近还发现cyclin D1蛋白在头颈部鳞癌手术切除标本中过度表达是独立的预后因素[1]。在本实验中，我们采用免疫组织化学染色方法检测了cyclin D1在鼻腔鼻窦恶性肿瘤和良性病变中的原位表达，并结合年龄、性别、病理类型及分级、TNM分期、病变部位 和复发情况等临床资料，探讨cyclinD1在鼻腔鼻窦肿瘤的发生、发展中所起的作用机制及临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料来源 收集山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉-头颈外科2001至2004年因鼻腔鼻窦恶性肿瘤及良性病变手术的石蜡标本30例，病理诊断均由2位病理医师做出。其中鼻腔鼻窦恶性肿瘤20例，男14例，女6例，38 78岁。依据病理分型可分为：鳞状细胞癌17例，腺癌3例;其中高分化10例，中分化7例，低分化3例。依据TNM分类标准：T1，2 8例，T3，412例;N0 17例，N13 3例;病例均无远处转移。初发病例18例，复发病例2例。鼻腔鼻窦良性病变10例，男7例，女3例，5 48岁，平均33岁。标本均取自与恶性肿瘤患者相似部位的组织，病理报告均为炎症或良性增生。

　　1.2 试剂 兔抗人cyclin D1纯化单克隆抗体IgG(MAB0016)(福建迈新生物有限公司)，即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。

　　1.3 检测方法 采用免疫组化SABC热修复抗原染色方法。常规4?μm连续切片，60?℃烤片过夜。石蜡切片常规脱蜡至水，3%的H2O2中室温5 10?min，灭活内源性酶。抗原热修复后,正常兔血清封闭室温20?min;滴加1∶50稀释的一抗，4?℃过夜，随后滴加生物素化兔抗山羊IgG，室温20?min;滴加链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)，室温20?min;滴加新鲜配置的DAB室温显色，镜下控制反应时间，一般在5 15?min之间。苏木素轻度复染，中性树胶封片。显微镜下观察计数。本实验均设有阳性及阴性(PBS代替一抗)对照。

　　cyclin D1染色以细胞核着色呈棕黄色，不论深浅均计为阳性细胞。根据1992年Pavelic等[2]的组织化学半定量方法,组织化学染色强弱判定由阳性细胞染色强度和阳性细胞所占百分率而定。细胞染色强度分为：0分为无色，100分为弱染色，200分为中等染色，300分为强染色。高倍镜下计数5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算其阳性率。染色强度与阳性细胞百分率相乘所得即为cyclin D1积分。

　　1.4 统计学处理 分析鼻腔鼻窦恶性肿瘤组与对照组cyclin D1积分，同时在鼻腔鼻窦恶性肿瘤组中就cyclin D1积分与患者的年龄、性别、病理类型、TNM分期、病理分级以及初发病例与复发病例之间行相关性分析。各组cyclin D1积分差异采用SPSS for windows 10.0软件行统计分析。所有资料均为计量资料，用±s表示，采用oneway ANOVA方法比较各组cyclin D1积分。

　　2 结 果

　　2.1 鼻腔鼻窦恶性肿瘤与良性病变之间cyclin D1表达的差异 在鼻腔鼻窦恶性肿瘤组织的阳性细胞中细胞核为棕黄色染色，在作为对照的良性病变组织中没有或仅有极少量的棕黄色染色，即偶见cyclin D1表达，恶性肿瘤较良性病变cyclin D1积分增加了约8倍。两者差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

　　ncyclin D1积分恶性肿瘤2088.21±9.45良性病变1011.33±5.58

　　P<0.05

　　2.2 鼻腔鼻窦恶性肿瘤中cyclin D1积分与年龄、性别的相关性 鼻腔鼻窦恶性肿瘤患者依据年龄分为70岁以上、60 69岁、50 59岁及49岁以下4个组。经统计学分析，cyclin D1积分与年龄、性别无相关性(P>0.05)，但随着年龄的降低积分有降低的趋势。

　　2.3 鼻腔鼻窦恶性肿瘤中cyclin D1积分与TNM分期、病理分级及复发病例的相关性 见表2。由表2可见，随着T分期升高，即肿瘤原发部位累及范围的增大，与之相对应的cyclin D1积分也随之增高，差异有统计学意义;同样，随着N分期升高，即淋巴结转移情况的加剧，cyclin　D1积分也随之增高，二者差异有统计学意义。cyclin　D1积分与病理类型无相关性，不同病理类型间cyclin　D1积分差异无统计学意义。随着分化程度的降低，eIF4E积分逐步升高;不同分化程度的鳞癌之间, cyclin　D1差异有统计学意义。复发病例的cyclin　D1积分较初发病例增加了26.81%，二者差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　Cyclin D1作为细胞周期G1期到S期的调节蛋白，定位于染色体11q13区，可竞争性地与细胞周期素依赖激酶(cdk)结合，控制cdk对蛋白磷酸化作用的能力，从而调整细胞周期的进展速度。在正常细胞和增殖细胞中cyclin D1保持不变[3]或呈低水平表达[4]。而在很多肿瘤中有过度表达，很可能是肿瘤发生的内在原因之一[5]。

　　1991年，Motokura等[6]首先在Nature上报道了在人甲状旁腺癌(parathyroid tumours)发生基因克隆重排和过表达，因而将这种基因命名为PRAD—1，其产物被按序命名为cyclin　D1。Cyclin　Dl在许多肿瘤中发现有扩增。Kurzrock等[7]的研究表明，cyclin　D1 mRNA在妇科鳞状上皮癌中的水平较正常二倍体成纤维细胞要高5 10倍以上。所以cyclin　D1可能也是一个癌基因，与其他癌基因协同作用于细胞恶性转化。我们检测20例鼻腔鼻窦恶性肿瘤和10例良性病变中cyclin　D1积分发现，恶性肿瘤的cyclin　D1积分为88.21±9.45，远大于良性病变的11.33±5.58，提示cyclin　D1可以作为鉴别肿瘤良恶性的一个简捷可靠的分子学指标。随着对cyclin　D1研究的不断深入，研究者们发现cyclin　D1不但与肿瘤的发生发展相关，而且与肿瘤的转移、预后也密切相关[8，9]。在本实验中随着肿瘤TNM分期和病理分级情况的加剧，cyclin　D1积分也表现出明显的增加趋势，并且各组之间差异有统计学意义，这一结果提示，cyclin　D1积分可以敏感地反映肿瘤的恶性程度，这与大多数研究的结果相吻合。因此原位检测cyclin　D1的表达也可以间接反映出肿瘤侵犯范围、淋巴结转移和分化程度。对于术前活检病理cyclin　D1高表达的病例，我们可适当采取相应的手术方式，弥补单纯体格检查的不足。复发病例的cyclin　D1积分显著高于初发病例，与肿瘤的恶性程度相结合，cyclin　D1可作为提示头颈部肿瘤预后的一个敏感指标，提示cyclin　D1积分高的患者术后应加强复查，以及早发现新的病情变化。

　　我们的研究显示，cyclin　D1可以在分子水平提示鼻腔鼻窦肿瘤的恶性程度、转移和复发，有助于评价肿瘤患者的临床预后，并指导治疗，延长患者的生存时间、改善生命质量。同时cyclin　D1免疫组织化学检测简单快捷，成本较低，便于在临床实践中推广应用。

　　【参考文献】

　　[1] Fracchiolla NS, Pruneri G, Pignataro L, et al. Molecular and immunohistochemical analysis of the bcl1/cyclin D1 gene in laryngeal squamous cell carcinomas: correlation of protein expression with lymph node metastases and advanced clinical stage[J]. Cancer, 1997, 79(6):11141121.

　　[2] Pavelic Z, Pavelic K, Cater C, et al. Heterogenity of cmyc expression in histologically similar infiltrating ductal carcinomas of the breast[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 1992, 118:1622,89.

　　[3] Matsushime H, Ewen ME, Strom DK, et al. Identification and properties of an atypical catalytic subunit (p34PSKJ3/cdk4) for mammalian D type G1 cyclins[J]. Cell, 1992, 71(2):323334.

　　[4] Ajchenbaum F, Ando K, DeCaprio JA, et al. Independent regulation of human Dtype cyclin gene expression during G1 phase in primary human T lymphocytes[J]. J Biol Chem, 1993, 268(6):41134119.

　　[5] Bartkova J, Lukas J, Muller H, et al. Cyclin D1 protein expression and function in human breast cancer[J]. Int J Cancer, 1994, 57(3):353361.

　　[6] Motokura T, Bloom T, Kim HG, et al. A novel cyclin encoded by a bcl1linked candidate oncogene[J]. Nature, 1991, 350(6318):512515.

　　[7] Kurzrock R, Ku S, Talpaz M. Abnormalities in the PRAD1(CYCLIN D1/BCL1) oncogene are frequent in cervical and vulvar squamous cell carcinoma cell lines[J]. Cancer, 1995, 75(2):584590.

　　[8] Khoo ML, Ezzat S, Freeman JL, et al. Cyclin D1 protein expression predicts metastatic behavior in thyroid papillary microcarcinomas but is not associated with gene amplification[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2002, 87(4):18101813.

　　[9] Khoo ML, Beasley NJ, Ezzat S, et al. Overexpression of cyclin D1 and underexpression of p27 predict lymph node metastases in papillary thyroid carcinoma[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2002, 87(4):18141818.