RNA干扰及其在喉鳞癌研究中的应用

　　作者：谢治年,综述,姬长友,审校　　作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所耳鼻咽喉-头颈外科， 重庆 400042

　　【关键词】 喉鳞癌

　　RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指一种双链RNA(doublestranded RNA, dsRNA)分子在mRNA(messenger RNA)水平关闭相应序列基因的表达后，使其沉默或表达下调，从而达到抑制某种特定基因表达的目的，是一种序列特异性的转录后基因沉默[1]。RNA干扰主要通过双链RNA被核酸酶切成21～23个小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)，这种siRNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成RNA诊导的沉默复合体,由此复合体介导使与双链RNA同源序列的信使RNA被降解,抑制基因表达;使细胞表现出特定基因缺失的表型,这是一种基因水平的生物自保护,起防止有害病毒或DNA破坏基因的作用。

　　1 RNA干扰技术简介

　　1.1 发现 当第一次将转基因导入植物细胞时，人们发现转基因的表达常常受到抑制。1989年，Matzke等[2]报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草，可引起转基因表达发生沉默。1990年，Napoli等[3]发现在牵牛花细胞中导入花色素苷基因不仅沉默了其自身表达，同时内源性基因的表达也发生沉默。该现象当时被称为基因表达共抑制或同源性依赖的基因沉默。在相当长一段时间内，转基因沉默被认为是植物独有的现象[4]。1995年，Guo等[5]发现用反义RNA能阻断线虫(c.elegans)par1基因的表达,但作为对照的正义链RNA,也同样阻断了该基因的表达。1998年，Fire等[4]的实验为这个令人费解的现象提供了注解，证实用于制备单链RNA(ssRNA)的常规实验方案，导致少量双链RNA(dsRNA)的形成;在除去dsRNA以纯化ssRNA后，反义ssRNA则丧失了大部分干扰活性，而正义ssRNA则完全没有活性，相反，dsRNA是干扰效应的有效诱导物。Fire并首次将dsRNA注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或反义链都要强得多的基因沉默。双链RNA 能够以同源互补序列的mRNA 为靶目标降解特定的mRNA,这个特异性和选择性抑制靶基因表达的过程称为RNA干扰。

　　随后, RNAi 在植物、真菌、涡虫、线虫、斑马鱼、果蝇、酵母等许多生物中被发现。1999年，哺乳动物中也发现存在RNAi 现象。因此,人们断定RNAi 是一种广泛存在于生物界的古老现象。RNAi的发现掀起了dsRNA介导的基因沉默作用分子机制生物学功能研究的热潮。

　　1.2 机制 目前已初步阐明RNAi的机制[4,6]。外源性或内源性的dsRNA在细胞内与内切核酸酶(一种具有Rnase样活性的核酸酶)结合，小分子RNA被切割成21～23nt且带有3′端单链尾巴及磷酸化5′端的短链dsRNA，即siRNA片段;由siRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体，即RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)，RISC中的siRNA随后变成单链，该单链siRNA识别同源靶mRNA，并引导RISC复合体结合mRNA;接着siRNA与mRNA在复合体中换位，内切核酸酶将mRNA切割成21～23nt的片段，离开的siRNA单链可能被降解，因为在体内检测的主要是反义siRNA;此后可出现两种情况：①siRNA继续延伸，产生的dsRNA再次进入RNAi途径;②带切口的mRNA被进一步降解，mRNA产生切口后，RISC复合体可能再进入循环，进行又一轮mRNA降解。因此，几个siRNA分子就可引起强烈的RNAi效应[7]。最近还有学者[8]提出，在RNAi途径中存在一个信号扩增的过程，siRNA还可以在RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase,RdRp)的作用下大量扩增并转运出细胞，使RNAi扩散到整个机体并传代。

　　1.3 特征[1,8,10,11,12] ①高针对性。RNAi 是siRNA 介导的转录后水平的基因沉默,这种作用是针对靶向基因的外显子序列, 而对其启动子或内含子序列却没有效应，外源基因也能被转录,但不能正常积累mRNA;②高特异性。小干涉RNA除正义链3′端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外,其他单个碱基改变就可能使RNAi失效,siRNA只高度特异地降解同源靶向mRNA, 并不影响其他基因mRNA表达;③高效率。siRNA 在比同源靶向基因mRNA 低几个数量级的浓度就可以抑制其表达,使目标基因表达降到极低水平甚至完全“剔除”;④ 高稳定性。以3′端悬垂TT碱基的双链RNA尤为稳定, 在细胞内可稳定存在3～4?d, 半衰期远长于反义寡聚核苷酸;⑤高穿透性和可遗传性。RNAi具有强大的细胞穿透能力,可在不同细胞间长距离相互传递和维持效应，甚至可以传递给子一代，如在线虫中干涉效应可通过生殖系传递到后代中去。

　　2 在临床上的主要应用

　　2.1 探查基因 RNAi作为强有力的研究工具在功能基因组学领域具有巨大的应用潜力。通过RNAi特异性地抑制基因的表达来阐明基因在生物体中的功能，较传统的基因敲除技术省时方便，且投入少、操作简单。RNAi还有一个优势就是逆基因分析，即已知特定的基因序列，通过阻断或下调这一特异基因的表达而出现功能或个体表型的改变，继而得到基因与其功能的相对应联系。人类基因组测序的完成使得利用该技术可快速、有效地大规模地开展基因功能的研究。

　　2.2 病毒性疾病的基因治疗 利用RNAi可以有效的抗病毒。2002年5月,Lee等[13]报道,采用21nt的ds RNA加入到感染艾滋病病毒的细胞中, 24?h后可减少艾滋病病毒基因表达90%以上,感染细胞的生长亦受到抑制。同年7月,Boden等[14]用RNAi技术实现了对HIV1病毒的阻抑。RNAi在乙型肝炎病毒(HBV)的研究方面近年来取得了较大的进展;由于HBV在HepG2 2.2.15 细胞株内可繁殖、表达，Kayhan[15]等通过培养HepG2 2.2.15细胞株作为HBV复制的模型，其构建了表达shRNA的重组质粒并将其转染入HepG2 2.2.15细胞，结果显示，shRNA特效的、明显地抑制了HBV DNA的复制，证明siRNAs可潜在被用来治疗乙型病毒性肝炎。Ying等[16]采用免疫荧光测量、FQPCR及RTPCR法，成功验证了RNAi在体外、体内均可抑制HBV的复制和表达。这些研究结果表明，RNAi可成为控制病毒在细胞内复制的重要工具，为病毒性疾病的治疗提供新的思路。

　　2.3 肿瘤的基因治疗 RNAi在肿瘤研究中的应用越来越广泛。采用合成的dsRNA和通过载体将dsRNA形成小发夹状dsRNA，可抑制癌基因的表达、阻止癌细胞生长，从而达到治疗肿瘤的目的。ras和myc是最常见的癌基因，Brummelkamp等[17]采用病毒载体介导RNAi，特异性降低Kras的表达，从而抑制肿瘤生长;Wang等[18]采用RNAi技术使MCF7细胞cmyc蛋白的表达量降低80%，显著抑制乳腺癌细胞的生长。此外，还可以采用RNAi沉默抗凋亡基因、促进癌细胞凋亡来达到治疗目的。通过对胃癌组织的基因表达分析发现，survivin是抗细胞凋亡基因，Miao等[19]用脂质体将重组siRNA质粒转染入胃癌SGC7901细胞株，48h后，RTPCR检测survivin基因的mRNA表达水平下降了44.52%，Western Blot法检测survivin蛋白的表达水平下降40.17%，并通过流式细胞计量法及MTT法证实下调survivi的表达后胃癌SGC7901细胞株在体外的生长、增殖受到了显著抑制，RNAi亦诱导其凋亡。肿瘤的生长和转移都依赖血管的生成，肿瘤实体内微血管的数量与肿瘤转移的潜能呈正相关。Chen等[20]设计siRNA抑制VEGFC的表达，显著降低肿瘤淋巴管和淋巴结的生成，从而抑制了肺癌的转移;Lv等[21]用siRNA封闭了人结肠癌细胞株HCT116的VEGF的表达，结果显示，在体外HCT116细胞的增殖显著减少;在裸鼠荷瘤动物模型中，皮下荷瘤生长受到明显抑制，其大小及微血管密度均显著减小、降低，从而，针对VEGF的靶向siRNA的构建为临床结肠癌的治疗创建了新的基础。以上相关研究证明，RNAi用于肿瘤的基因治疗是可行、有效的，不仅可抑制癌基因表达，还可使肿瘤生长减慢、肿瘤细胞凋亡速度加快，提示RNAi技术在肿瘤的基因治疗方面具有良好应用前景。

　　3 RNA干扰在喉鳞癌研究中的应用及展望 喉鳞癌同其它恶性肿瘤一样，其发生、发展是一个多基因突变、多阶段的复杂过程，其发生机制主要是各种因素相互作用引起原癌基因的激活、抑癌基因的失活，以及凋亡相关基因的异常表达过程，部分自分泌生长因子和受体的相互作用以及部分关键酶的过量表达与细胞癌变也有密切关系。目前国内外将RNAi技术应用于喉癌研究的报道较少。

　　刘丹等[22]根据hTERT(humantelomerase reverse transcriptase, 人端粒酶逆转录酶)cDNA 序列构建了表达hTERT mRNA 特异的、含荧光素基因的shRNA (short hairpinRNA，短发夹RNA)真核表达质粒pshRNA，建立人喉癌Hep2 细胞株裸鼠皮下接种模型，将pshRNA 转染入荷瘤裸鼠瘤体内, 观察肿瘤生长情况。结果显示，pshRNA 组肿瘤生长受到抑制, 细胞分裂相少见, 可见大量肿瘤细胞坏死及凋亡, 该组肿瘤细胞的凋亡指数明显高于空质粒载体组和生理盐水组，给予pshRNA后瘤体内hTERT蛋白表达明显下调，从而验证了表达shRNA 的DNA 载体质粒沉默hTERT 基因可显著抑制人喉癌裸鼠肿瘤的生长。池花明等[23]同样根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1，采用METAFECTENE作为转染试剂转染喉癌Hep2细胞，结果pshRNA1转染组hTERT蛋白表达显著下调,大量Hep2细胞凋亡，这在体外也验证了RNAi抑制hTERT基因表达能有效诱导喉癌Hep2细胞凋亡。陈雄等[24]设计出VEGF4个位点的干扰序列，将4个位点的PCR产物分别转染指数生长期的Hep2细胞，48h后观察和检测RNAi后的效果，结果表明靶向VEGF的1366位点的siRNA表达框架能高效抑制喉癌Hep2细胞的生长。Sun等[25]构建了干扰MMP2(间质金属蛋白酶)和MMP9基因的慢病毒重组体，将其导入Hep2细胞，并创建了喉鳞癌的裸鼠荷瘤模型;通过在异种动物瘤体内增殖的细胞的核抗原(PCNA)的表达情况来评价Hep2细胞的增殖改变，从而间接地检测干扰载体对肿瘤的抑制效应。结论显示慢病毒介导的MMP2和MMP9基因共沉默显著抑制了喉鳞癌的生长、增殖。此外，目前已知ras基因、cmyc基因都与喉鳞癌相关，如本文前述，运用RNAi手段抑制其活性可成功的抑制不同癌细胞的增殖，但在喉鳞癌研究中还未见报告，应用RNAi技术抑制此类基因的表达，有望达到抑制喉鳞癌细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的目的。

　　肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF) 与其特异性受体cMet构成的HGF/cMet信号通路在肿瘤的发生发展过程所起作用近些年来也得到大量的研究。国外已有学者研究证实，在正常喉黏膜中HGF/cMet系统不表达或少量表达，Sawatsubashi等[26]用免疫组化对82例喉癌病理组织研究发现，在喉鳞状上皮癌及其转移淋巴结里均有HGF/cMet高表达，且在上皮组织恶变时的表达与淋巴结状况呈正相关(P<0.04);Yucel等[27]在对60例声门上型癌(30例有颈部淋巴结转移，30例无颈部淋巴结转移)的研究中发现，在90%的瘤体中CMet的高表达，在83%的转移淋巴结中有CMet的高表达。由此，阻断HGF/cMet信号转导系统的信号转导可有效的抑制喉癌的侵袭和转移，成为抗喉癌治疗的新途径。采用RNAi手段下调或沉默cMet基因的表达，也可有望成为治疗喉癌的一个新的方法和靶点。

　　4 结束语

　　RNAi是近10年来兴起的一项更高效、特异、彻底的转录后基因沉默技术，已成为基因功能研究的强大工具，同时在基因干预治疗中具有很大潜力。虽然RNAi技术仍然存在很多亟待解决的问题，例如RNAi机制仍不是十分清楚、提高肿瘤细胞的靶向性问题、如何找到一种高效而低毒的用于人体的运转载体等问题都需要进一步研究。但随着相关技术的不断成熟和深入，RNAi必将成为基因功能研究和疾病基因治疗尤其是肿瘤的基因治疗的革命性工具，预期将有广阔的发展前景。

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