水通道蛋白亚型1～5在人鼻黏膜中定位及意义

　　作者：朱建国,赵小冬,雷菲　赵丹　　作者单位：吉林大学中日联谊医院耳鼻喉科，吉林 长春

　　【摘要】 目的 研究水通道蛋白亚型(AQPs)在人鼻黏膜组织不同部位的表达分布及其生理意义。方法 取18例单纯行鼻中隔矫正术患者的鼻黏膜，经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，应用免疫组化技术检测AQP1、2、3、4、5在鼻黏膜组织中分布情况。结果 AQP1、2、4为1∶1 000;AQP3为1∶300;AQP5为1∶400的一抗浓度可以观察到它们在鼻黏膜组织不同部位稳定、清晰的染色反应。AQP1在腺上皮细胞膜、腺腔腔面膜、纤毛和血管内皮处被标记;APQ2在基底膜处表达很强;AQP3 和AQP4在浆液腺上皮细胞胞浆内表达清晰;AQP5在纤毛、基底膜、腺上皮细胞胞浆处有广泛表达。结论 AQP1、2、3、4、5广泛分布于鼻黏膜组织不同部位，其定位分布和反应强弱存在差异，每种AQP的调节可能都是单一的。

　　【关键词】 水通道蛋白;鼻黏膜;免疫组织化学

　　AQP是一个完整的细胞膜蛋白家族，它只转运水和一些小分子溶质，如甘油、尿素等。AQP可增加细胞膜对水的渗透性，比脂质双层对水的渗透性强5～50倍。研究表明目前已发现至少有13种AQP(AQP0～12)家族成员，它们在哺乳动物组织的上皮细胞、内皮细胞及其他类型细胞表达。不同的AQP成员具有特异的组织分布并参与特定的生理功能。在啮齿类和其他几种动物体内AQPs的表达与分布已被广泛研究〔1，2〕，但在人类组织中的研究受到限制，尤其是在人鼻黏膜组织中的定位表达尚未见报道。本研究通过免疫组化方法对人鼻黏膜不同部位AQP不同亚型的分布情况进行研究，探讨其生理意义，为临床诊治提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料制备

　　18例鼻甲黏膜标本取自单纯行鼻中隔矫正术患者，男10例，女8例，年龄36～67岁。组织离体后经4%多聚甲醛固定48 h。

　　1.2 组织切片

　　石蜡包埋组织连续切片，切片厚度为3 μm，置于40℃恒温水浴箱中，然后将切片捞到载玻片上置于展片器上，放到37℃烤箱中干燥。

　　1.3 免疫组织化学标记

　　将切片加热50～60℃ 1 h，用二甲苯和梯度乙醇(100%、95%、70%、50%)系列脱蜡脱水，各2次，每次5 min。用0.01 molL PBS洗2次，每次5 min。用蒸馏水新鲜配制3% H2O2，室温5～10 min，淬灭内源性过氧化物酶活性，用0.01 molL PBS 洗3次，每次5 min。在标本上滴加封闭液(PBS中含5%正常羊血清白蛋白)，置于湿盒中封闭1 h，分别加入不同亚型的AQP抗体，根据预实验结果确定抗体的浓度分别是AQP1、2、4为1∶1 000;AQP3为1∶300;AQP5为1∶400。切片放在封闭的湿盒中，置于4℃下过夜。用PBS洗3次，每次5 min，滴加生物素标记的二抗(羊抗兔IgG)Strept Avidinenzyme Complex，SABC免疫组化试剂盒购自博士德生物技术公司，浓度为1∶500，37℃ 20 min，PBS洗3次，每次3 min。滴加试剂SABC，20～37℃ 60 min，0.01 molL PBS洗4次，每次5 min。DAB显色，参照DBA显色试剂盒说明书操作。苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。显微镜观察结果。

　　2 结 果

　　本研究应用免疫组化方法，对AQPs在正常人鼻黏膜中的分布进行了检测，由于AQPs对生物素标记反应强弱不同，因此抗体实验浓度存在差异，AQP1、AQP2、AQP4浓度为1∶1 000，而AQP3浓度为1∶300，AQP5浓度为1∶400，但其一抗浓度均有稳定、清晰的标记反应。

　　AQP1主要分布在腺上皮细胞膜、腺腔腔面膜、纤毛和血管内皮细胞膜上，抗体浓度稀释至1∶1 000仍有很强的标记反应。而在基底膜或其他部位标记反应却非常弱或无表达。AQP2的分布主要表现在被覆层黏膜下基底膜，而且标记颜色表达很强，但在黏膜组织的其他部位却无表达。AQP3、AQP4标记反应主要分布靠近黏膜下浆液腺细胞内，且非常规律清晰。AQP5标记反应的分布则较为广泛，在纤毛、基底膜，腺上皮细胞膜部位都有较强的表达，在靠近腔缘的细胞则表达较弱。由此可见，不同的AQP亚型在鼻黏膜组织不同部位有着强弱不等的表达反应。见表1、图1～图6。表1 不同AQP亚型在正常人鼻黏膜组织表达分布(略)

　　3 讨论

　　早在1980年代人们对水通道就有了一定认识，但其在水转运中的作用只是在新近研究中才得以发现〔3，4〕。到目前为止，已发现13种水通道蛋白亚型，分别在不同组织结构中对水的代谢起着重要作用，AQPs可快速和选择性促进水的跨膜运动〔5〕。笔者通过免疫组化方法研究发现在人鼻黏膜组织中有AQP1、2、3、4、5等5种亚型表达，并证实它们分别存在于不同的组织细胞部位，本研究的前期工作发现AQP2在大鼠的鼻黏膜中无表达〔6〕，而在人的鼻黏膜基底细胞中有着很强的表达。

　　细胞渗透压调节对所有组织的功能调节都具有重要作用，水通道蛋白形成细胞膜孔，可选择性渗出水和某些水的非极性溶液(如甘油和尿素)，而有些水通道蛋白的同分异构体几乎广泛分布在各组织中，并担负着这些组织结构的水调节功能。从本研究免疫组化标记结果可以看出，尽管在鼻黏膜不同部位，各水通道蛋白亚型是否反应或反应强弱存在差异，其反应主要集中在与纤毛、间质、细胞基底膜、浆液腺上皮细胞，胞浆关系密切的部位，且反应的亚型种类也有所增加。如AQP1、5，尤其是AQP1在体内分布十分广泛，参与人体多种生理功能的调节，对维持人体正常生理状态具有重要作用。研究表明AQP1表达异常或调节失控与某些疾病的水肿和渗出密切相关。有时嗜中性粒细胞在持续感染的刺激下还会释放出嗜酸粒细胞离子蛋白〔7，8〕;其次AQP1不仅在发病之初嗜酸粒细胞趋化迁移过程中起重要作用，而且还和炎性局部嗜酸粒细胞凋亡关系密切〔9〕。可见不同水通道蛋白亚型在鼻黏膜组织不同部位的表达，对维持其正常的生理功能具有重要意义。鼻黏膜固有层中有大量的腺体，其分泌性腺细胞为锥体形的浆液性腺细胞，可分泌稀薄的水样浆液，AQP1、3、4在黏膜组织的这种分布特点及表达，有利于浆液的分泌并顺利经导管转运至上皮表面。一方面维持纤毛周围的水分，保护纤毛转运功能;另一方面完成对吸入空气的加湿作用。为这一过程提供了快速进入细胞途径，并以此促进细胞运动〔10〕。 本研究发现在上皮基底膜细胞中AQP1、3、4无表达或表达较弱，其结果致使液体运输通路障碍，不利于液体运转。但在研究结果中发现AQP2和AQP5在此部位有着很强的表达，推测很可能是它们对液体运转的促进作用，避免分泌和渗出的液体大量聚集在组织间隙中形成水肿起着一定调控功能。这些结果提示在鼻黏膜细胞代谢中，包括分泌和吸收，可能存在着多个水通道蛋白的共同参与，它们之间相互作用和对细胞渗透性调节可能需要特定的水通道蛋白发挥作用〔7〕。也就是说，虽然可能出现不同的或共有的特征，每一种水通道蛋白的调节可能是单一的〔11〕。目前的研究结果基本上还只是揭示表现特征，而不同水通道蛋白亚型在鼻黏膜不同部位如何发挥作用的机制，还有待进一步研究。鼻腔黏膜中含有大量黏液及浆液腺体，这些腺体的分泌物和大分子气体在保持气道内表面液体平衡和抵御细菌侵入过程中起着重要的作用〔12，13〕。人鼻黏膜水通道蛋白的研究是近年开展的一项新的研究方法，对于人们认识鼻黏膜水代谢机制及液体分泌和吸收具有重要意义，也有助于理解和认识某些疾病(如鼻息肉等)水代谢障碍的发生机制，并为有效防治这类疾病提供了依据。

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