STAT3在喉癌中的表达特征及其与Survivin表达的关系

　　作者：张寒冰,张道宫,潘新良,栾信庸　　作者单位：山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉-头颈外科， 济南 250012;山东大学附属省立医院耳鼻咽喉-头颈外科， 济南 250021

　　【摘要】探讨信号传导与转录激活因子3(STAT3)在喉癌中的表达特征及其与Survivin表达的关系。方法 采用免疫组织化学方法检测40例喉鳞状细胞癌组织和12例喉正常黏膜组织中STAT3、磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白和Survivin蛋白的表达;运用逆转录多聚酶链式反应(RTPCR)检测上述组织中STAT3 mRNA和Survivin mRNA的表达。结合病例资料进行统计学处理，采用χ2、t检验。结果 喉癌组织中STAT3、pSTAT3和Survivin蛋白及STAT3 mRNA和Survivin mRNA的阳性表达率均明显高于正常喉黏膜(P<0.01); STAT3、pSTAT3蛋白和STAT3 mRNA在喉癌中的表达均与喉癌的临床分期相关(分别为P<0.05、P<0.01、P<0.01);Survivin蛋白和 Survivin mRNA在喉癌中的表达与临床分期及淋巴结转移相关(P<0.01，P<0.01)STAT3和Survivin的表达呈正相关。结论 STAT3的过量表达可能在喉癌的发生、发展中起重要作用，它的异常激活也可能通过上调Survivin基因的表达，延长喉癌细胞生存时间。

　　【关键词】 喉肿瘤 信号传导与转录激活因子3 生存素 逆转录多聚酶链式反应 免疫组织化学

　　STAT3 expression in laryngeal carcinoma tissues and its relation with Survivin expression

　　ZHANG Hanbing, ZHANG Daogong, PAN Xinliang, LUAN Xinyong, XIE Guang

　　(Department of Otolaryngology & Head and Neck Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China;Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China)

　　To investigate the expression characters of signal transducer and activator of transcription 3(STAT3) and its relation with the expression of Survivin in laryngeal carcinoma. Methods Immunohistochemistry (IHC) was used to determine the protein expressions of STAT3, pSTAT3 and Survivin in 40 laryngeal squamous cell carcinoma tissues and 12 normal control laryngeal mucous tissues. Also RTPCR was used to determine the expressions of STAT3 mRNA and Survivin mRNA. Results The expressions of STAT3, pSTAT3 and Survivin protein in laryngeal carcinoma tissues were significantly higher than those in normal laryngeal tissues (P<0.01). And the expressions of STAT3 mRNA and Survivin mRNA were significantly higher in laryngeal carcinoma tissues than those in normal laryngeal tissues (P<0.01). Positive expressions of STAT3, pSTAT3 protein and STAT3 mRNA were correlated with the clinical stage and had no relationship with patient age, tumor position, histological grade, and lymph node metastasis, and also positive expression of Survivin protein and Survivin mRNA was correlated with the clinical stage and lymph node metastasis. There were positive correlations between STAT3 and Survivin expression in laryngeal carcinoma. Conclusions Overexpression of STAT3 may play an important role in the genesis and growth of laryngeal carcinoma. STAT3 may prolong the survival time of laryngeal carcinoma by increasing the expression of Survivin.

　　Key words： Laryngeal neoplasms; Signal transducer and activator of transcription 3; Survivin; RTPCR; Immunohistochemistry

　　信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)作为癌基因参与多种生理进程，包括细胞增殖、分化、凋亡，在多种肿瘤细胞中激活，但其在喉癌中的研究报道非常有限。Survivin是最近发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中的新成员，具有抑制细胞凋亡和促进细胞增殖的作用，在大多数正常成熟组织均测不到其表达或低表达，而在大多数肿瘤中高表达。我们从蛋白和基因水平检测STAT3与Survivin在喉癌组织中的表达，探讨和明确STAT3信号传导通路对喉癌组织中Survivin表达的影响，及其与肿瘤恶性潜能的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本来源 2000年4月至2003年9月，山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉头颈外科喉癌手术标本40例，所有患者均为首次接受手术治疗，术前未行放、化疗，术后病理结果均为鳞状细胞癌(高、中、低分化为15、16、9例)。男36例，女4例，39～71岁，平均56岁。声门上区14例，声门区23例，声门下区3例;临床TNM分期(UICC ，2002年)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期为8、7、13、12例;术后病理证实颈淋巴结转移阳性14例。正常对照组取自同期行喉部手术的正常喉黏膜标本12例(为喉外伤或喉狭窄整复患者)，男8例，女4例， 30～62岁，平均42岁。所有标本均于术中取材，分为二部分，分别用10%福尔马林液中固定和-80℃冰箱中保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组化检测STAT3、pSTAT3和Survivin蛋白的表达 兔抗人STAT3多克隆抗体、兔抗人Survivin多克隆抗体、免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司，兔抗人磷酸化STAT3多克隆抗体(Tyr705)购自美国Cell signaling 公司。所有标本取材后用40g/L甲醛固定，梯度脱水，透明，浸蜡，包埋，4μm连续切片，分别进行HE染色和免疫组化(SABC法)染色。按试剂盒说明检测三者表达，用PBS代替一抗作为阴性对照，试剂公司提供的已知阳性切片作为阳性对照，结果判断：STAT3、Survivin蛋白以在肿瘤细胞胞浆或细胞核中出现淡黄至棕褐色颗粒者为阳性细胞，凡细胞胞浆或细胞核显色强度与背景无明显差别者为阴性细胞。每例标本以400倍光镜下随意选取10个视野，计数每个视野中100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均数求其阳性百分率作为结果。采用半定量积分方法，先根据染色的深浅打分：0分(无色)，1分(淡黄色)，2分(棕黄色)，3分(棕褐色);再按阳性细胞所占百分比打分，0分(<5%)，1分(5%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(>75%)。二者相乘即为该片的积分，≤1记为阴性，>1记为阳性。所有染色切片均由山东大学齐鲁医院3位高年资病理学工作者盲法判定，当2位判定一致时，则确认为该片数据。磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白主要定位于细胞核，统计pSTAT3表达结果时，计胞核表达者为阳性细胞，染色强度以胞核染色定，胞浆染色而胞核未着色者不计在内，余同STAT3。

　　1.2.2 RTPCR测定STAT3 mRNA和Survivin mRNA的表达 应用Trizol一步法提取组织总RNA，先逆转录成cDNA,再进行PCR扩增，扩增条件为：94℃、58℃、72℃均为1min;共35个循环，最后72℃延长7min。从Gene Bank中查找人Survivin的cDNA基因序列，www. Genefisher.com在线引物设计软件中对Survivin cDNA 进行引物设计，STAT3参照文献[1]中设计的引物序列，并经基因文库检索无误后，委托上海博亚生物技术有限公司合成。βactin 引物作为内参对照，各引物序列及产物片断长度如下，STAT3mRNA的引物扩增片段为238bp，其序列上游: 5′ ATT CAA ACA CTT GAC CCT GA 3′，下游:5′ ATT GTT GGT CAG CAT GTT GT3′; Survivin mRNA引物扩增片段为439bp，其序列上游: 5′GGC ATG GGT GCC CCG ACG TT3′，下游: 5′AGA GGC CTC AAT CCA TGG CA3′;内参照βactin mRNA引物扩增片段为317bp，其序列上游: 5′ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A 3′，下游: 5′CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA 3′。结果判定：RTPCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳并在紫外光投射下观察分析，在相应位置出现目标条带者为阳性，未出现目标条带者为阴性。

　　1.3 统计学处理 应用SPSS10.0软件分析，采用χ2、t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 免疫组织化学方法检测喉癌组织中STAT3、pSTAT3和Survivin蛋白的表达及其与喉癌临床特征的关系 STAT3、PSTAT3和Survivin蛋白均在喉癌组织中高水平表达。STAT3蛋白主要定位于细胞浆，细胞核中也有表达(彩图35);pSTAT3蛋白主要定位于细胞核(彩图36);Survivin蛋白主要在细胞浆中表达，细胞核中也有表达(彩图37)。40例喉鳞状细胞癌组织中，STAT3、pSTAT3和Survivin蛋白的阳性表达率分别为82.5% (33/40)、67.5%(27/40)、75.0%(30/40)，12例喉正常黏膜组织中，三者的阳性表达率分别为25.0%(3/12)、8.3%(1/12)、25.0%(3/12)。STAT3、pSTAT3和Survivin蛋白在喉癌组织中表达增高，与正常喉黏膜相比，差异有统计学意义(χ2值分别为11.76、13.00和7.91，P<0.01)。STAT3、和pSTAT3蛋白在Ⅲ、Ⅳ期喉癌的阳性表达率分别为96.0%和92.0%，在Ⅰ、Ⅱ期喉癌中分别为60.0%和26.7%，差异有统计学意义(分别为P<0.05, P<0.01)。STAT3、pSTAT3蛋白在喉癌中的表达与患者性别、年龄、肿瘤病理学分级、临床分型、淋巴结转移等因素无关(P>0.05，表1)。Survivin蛋白在Ⅰ、Ⅱ期喉癌和Ⅲ、Ⅳ期喉癌中的阳性表达率分别为46.7%和92.0%，差异有统计学意义(P<0.01);在淋巴结转移组和未转移组中的阳性率分别为100.0%和61.5%，差异有统计学意义(P<0.01);Survivin蛋白的表达与患者性别、年龄、肿瘤病理学分级、临床分型等因素无关(P>0.05，表1)。(略)

　　2.2 STAT3 mRNA和Survivin mRNA在喉癌中的表达及其与喉癌临床特征的关系 STAT3 mRNA在喉癌和喉正常黏膜组织中的阳性表达率分别为80.0%和16.7%(图1)，Survivin mRNA在喉癌和喉正常黏膜组织中的阳性表达率分别为70.0%和0.0%(图2)，差异均有统计学意义(χ2值分别为13.68和18.20，P<0.01)。STAT3 mRNA在喉癌中的表达与临床分期相关(P<0.01)，与患者性别、年龄、肿瘤病理学分级、临床分型、淋巴结转移等因素无关(P>0.05)。Survivin mRNA在喉癌中的表达与临床分期及淋巴结转移相关(P<0.01)，与患者性别、年龄、肿瘤病理学分级、临床分型等因素无统计学相关(P>0.05，表2)。(略)

　　2.3 STAT3和Survivin在喉癌组织中表达的相互关系 经Spearman相关分析，STAT3蛋白和pSTAT3蛋白均与Survivin蛋白表达呈正相关(r分别为0.494、0.462, P<0.01);STAT3 mRNA和Survivin mRNA在喉癌组织中表达也呈正相关(r=0.491, P<0.01)。上述二者关系差异均有统计学意义。

　　3 讨论

　　有学者[2]发现，STAT3信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化。Bowman等[3]证实STAT3在多发性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌及肺癌等多种肿瘤组织与细胞系中异常表达或活性增强，提示STAT3调控异常与肿瘤发生发展密切相关，但目前关于STAT3在喉癌中的研究较少。我们应用STAT3和pSTAT3两种抗体，前者检测STAT3蛋白的总体表达情况，即包括STAT3的活性和非活性状态;后者能与pSTAT3酪氨酸705位点反应，检测STAT3的活性状态，可以识别喉癌组织标本中STAT3的活化形式，分析具有活性的pSTAT3蛋白表达与喉癌各临床病理因素之间的关系。我们将两种抗体联合应用于喉癌组织标本的检测，能更系统地探讨STAT3在喉癌发生中的作用。

　　Survivin是主要分布于胚胎及分化未成熟的组织，在成人除子宫内膜组织、胎盘和胸腺组织中发现存在不同程度的Survivin基因表达外[45]，在大多数正常成熟组织均测不到其表达或低表达，但在大多数人类肿瘤中高表达。

　　目前关于Survivin和细胞信号传导间关系的研究较少。Aoki等[6]报道，IL11可以通过STAT3介导的信号通路来诱导Survivin基因的表达，抑制STAT3可以抑制Survivin基因的表达。理论上推测，能激活STAT3的生长因子受体或非受体型酪氨酸激酶或癌基因产物，应该也能诱导Survivin基因的表达，SurvivinSTAT3通路可能和肿瘤的形成密切相关。有研究[7]表明，活化的STAT3可诱导Survivin基因的表达，STAT3和Survivin均在多数肿瘤组织中表达增强，二者之间可能存在一定的联系。Kanda等[8]发现，胃癌细胞中存在STAT3的持续活化，抑制STAT3活化降低了胃癌细胞中Survivin蛋白的表达，促进胃癌细胞的凋亡。而向细胞中转入Survivin基因并稳定表达后，可逆转STAT3抑制剂诱导的促凋亡作用。Gritsko等[9]运用微阵列分析研究指出，在乳腺癌细胞中Survivin是STAT3调节的靶基因之一。其作用机制是STAT3直接与Survivin启动子结合并调节其转录。以上研究结果均表明，STAT3和Survivin之间可能存在着联系，但关于二者在喉癌中关系的研究尚未见报道。

　　我们通过免疫组化和RTPCR方法检测了40例喉鳞状细胞癌组织标本和12例喉正常黏膜中STAT3和Survivin蛋白和基因水平的表达，发现STAT3及Survivin均在喉癌组织中高表达，与正常喉黏膜相比，差异有统计学意义，表明STAT3和Survivin可能参与了喉癌的形成;STAT3的表达与喉癌的临床分期有关，Survivin的表达与喉癌的临床分期及淋巴结转移相关，提示STAT3和Survivin可能参与喉癌的发展、侵袭过程，并导致不良预后，提示二者可作为肿瘤诊断、预后和治疗的新指标。

　　我们的研究证明，STAT3和Survivin二者在喉癌中的表达呈正相关，Survivin可能是喉癌中STAT3的下游靶基因之一，STAT3可能通过促进抗凋亡基因Survivin的表达，参与喉癌的形成。提示抑制STAT3 的表达和/或生物学活性有可能是防治喉癌发生和发展的潜在途径之一。黄陈等[10]报道了通过阻断STAT3信号传导通路可以抑制胰腺癌细胞体外侵袭转移能力，为预防和治疗胰腺癌的侵袭转移提供了新的策略。

　　【参考文献】

　　[1] Rivat C, Rodrigues S, Bruyneel E, et al. Implication of STAT3 signaling in human colonic cancer cells during intestinal trefoil factor 3 (TFF3) and vascular endothelial growth factormediated cellular invasion and tumor growth[J]. Cancer Res, 2005, 65(1):195202.

　　[2] Bromberg J F, Wrzeszczynska M H, Devgan G, et al. Stat3 as an oncogene[J]. Cell, 1999, 98(3):295303.

　　[3] Bowman T, Garcia R, Turkson J, et al. STATs in oncogenesis[J]. Oncogene, 2000, 19(21):24742488.

　　[4] Lehner R, Enomoto T, McGregor J A, et al. Correlation of survivin mRNA detection with histologic diagnosis in normal endometrium and endometrial carcinoma[J]. Acta Obstet Gynecol Scand, 2002, 81(2):162167.

　　[5] Hirohashi Y, Torigoe T, Maeda A, et al. An HLAA24restricted cytotoxic T lymphocyte epitope of a tumorassociated protein, survivin[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8(6):17311739.

　　[6] Aoki Y, Feldman G M, Tosato G, et al. Inhibition of STAT3 signaling induces apoptosis and decreases survivin expression in primary effusion lymphoma[J]. Blood, 2003, 101(4):15351542.

　　[7] Kim K W, Mutter R W, Cao C, et al. Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 activity results in downregulation of Survivin following irradiation[J]. Mol Cancer Ther， 2006, 5(11):26592665.

　　[8] Kanda N, Seno H, Konda Y, et al. STAT3 is constitutively activated and supports cell survival in association with survivin expression in gastric cancer cells[J]. Oncogene, 2004, 23(28):49214929.

　　[9] Gritsko T, Williams A, Turkson J, et al. Persistent activation of stat3 signaling induces survivin gene expression and confers resistance to apoptosis in human breast cancer cells[J]. Clin Cancer Res, 2006, 12(1):1119.

　　[10] 黄陈，裘正军，曹俊，等. AG490抑制人胰腺癌细胞侵袭转移的体外研究[J]. 中华肿瘤杂志，2006，28：890893.