CXCR4和VEGFC在喉癌中的表达及与淋巴结转移的关系

　　作者：王海涛,金宏林,王莹,金春顺　　作者单位：吉林大学第二医院耳鼻喉科，吉林 长春

　　【摘要】目的 探讨趋化因子受体(CXCR4)和血管内皮生长因子C(VEGFC)在人喉癌组织中的表达及与淋巴结转移之间的关系。方法 选择65例喉癌组织标本，应用免疫组织化学染色方法，检测CXCR4 和VEGFC在人喉癌组织中的表达，同时对其与临床病理参数的关系进行统计学分析。结果 CXCR4和VEGFC蛋白在喉癌组织中呈强阳性表达，且CXCR4和VEGFC蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05);CXCR4和VEGFC蛋白表达水平在淋巴结转移组较无淋巴结转移组均明显升高(P<0.05)。结论 CXCR4 和VEGFC 与喉癌的淋巴结转移密切相关，联合检测其在喉癌组织中的表达有助于预测淋巴结转移的发生。

　　【关键词】 趋化因子受体;血管内皮生长因子C;喉癌;淋巴结转移

　　喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，淋巴结转移是喉癌的主要生物学特征，是肿瘤患者致死的主要原因。研究表明，趋化因子受体(CXCR4)在多种恶性肿瘤中高表达并与淋巴结转移密切相关。血管内皮生长因子C(VEGFC)是VEGF家族的新成员，被认为是特异性的新生淋巴管刺激因子，可促进肿瘤淋巴转移，但在人喉癌淋巴转移机制中，CXCR4与VEGFC是否有相关性未见报道。本研究运用免疫组织化学的方法，检测喉癌组织中CXCR4和VEGFC的表达及与肿瘤淋巴结转移的相关性，探讨CXCR4与VEGFC在喉癌淋巴结转移机制中的作用，为进一步筛选肿瘤转移相关标记物，设计预测肿瘤转移的基因芯片，探索干预喉癌淋巴结转移的有效措施提供新的理论基础和治疗靶点。

　　1 临床资料

　　1.1 资料来源

　　喉癌手术切除标本65例，男40例，女25例;年龄40～72岁(平均56.2岁);对照组标本65例取自距癌组织0.5～1.0 cm;同时取10例正常喉黏膜。喉癌术前未经放疗或化疗，病理学诊断均为喉鳞状细胞癌，根据国际抗癌协会(UICC)TNM(1997)分期方案进行分类分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期16例，Ⅲ期27例，Ⅳ期10例，无远处脏器转移。病理学分级：高分化15例，中分化31例，低分化19例。其中48例有颈淋巴结转移，17例无颈部淋巴结转移。

　　1.2 方法

　　SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司，CXCR4一抗为兔抗人，二抗为羊抗兔，VEGFC兔抗人抗体为Upstate公司产品。采用链酶素亲和生物素过氧化物酶法(SP法)进行免疫组化染色。石蜡切片常规脱蜡至水。经3% H2O2 封闭内源性过氧化物酶及微波加热抗原修复后,滴加非免疫性动物血清室温10 min ,之后滴加一抗，4℃孵育过夜,然后滴加二抗37℃孵育30 min,随后滴加链霉素亲和素过氧化酶溶液37℃孵育10 min,最后每张切片滴加新配制的DAB 溶液显色5～10 min。显微镜下观察流水冲洗终止反应,苏木素复染,常规脱水透明封片。用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3 结果判定

　　以细胞质内出现淡黄色至棕黄色为阳性染色，400倍光镜下随机选取5个视野，以定位明确，染色明显，平均20%以上细胞染色的组织视为表达阳性。

　　1.4 统计学处理

　　统计工具应用SPSS10.0 软件包，统计方法采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 CXCR4 的表达

　　CXCR4蛋白在正常喉黏膜中无表达，在喉鳞癌中染色阳性率为72.3%，显著高于癌旁组织组织的阳性率13.8%，喉癌组织与癌旁组织比较差异有显著性(P<0.05)。

　　2.2 VEGFC 的表达

　　VEGFC蛋白在正常喉黏膜中无表达，在喉鳞癌中染色阳性率为61.5%，显著高于癌旁组织的阳性率12.3%，喉癌组织与癌旁组织比较差异有显著性(P<0.05)。

　　2.3 CXCR4和VEGFC表达与临床病理参数的关系

　　见表1。喉癌CXCR4 的表达与病人的年龄、性别无相关性(P>0.05)。而与分化程度及TNM分期，淋巴结转移有相关性(P<0.05)。表1 CXCR4，VEGFC与喉癌临床病理特征的关系(略)

　　VEGFC在喉癌组织中的表达在病人的年龄、性别、病理分化程度均无统计学差异，无相关性。VEGFC在喉癌组织中的表达与TNM分期，淋巴结转移有相关性(P<0.05)。

　　2.4 CXCR4 表达和VEGFC 表达之间的相关性

　　相关分析显示，CXCR4 阳性表达与VEGFC 阳性表达呈显著正相关(P<0.05)。

　　3 讨论

　　趋化因子是一类能使细胞发生趋化运动的低分子量(8 000～10 000)细胞因子，其行使功能需要由趋化因子受体来介导。趋化因子受体是一类表达于不同类型细胞上的G 蛋白耦联受体，含有7个跨膜区。目前发现至少有23种不同类型肿瘤的恶性细胞表达趋化因子受体CXCR4，并与其特异性配体CXCL12相应答，这种受体配体相互配对似乎与癌细胞定向迁移到转移的部位有关〔1〕。迄今为止，CXCL12/CXCR4生物学轴在肿瘤转移中的作用已分别在乳腺癌、非小细胞肺癌、横纹肌肉瘤等的研究中得到证实。已有研究表明在头颈鳞癌中，CXCR4通过诱导细胞内钙离子动员,活化细胞外信号调节激酶，并介导分泌基质金属蛋白酶9,降解Ⅳ型胶原纤维而破坏基底膜和诱发新生血管形成重建肿瘤局部微环境，使之有利于癌细胞的侵袭和转移〔2〕。

　　VEGFC是VEGF家族中第一个被发现的淋巴内皮细胞生长因子，定位于染色体4q34上，VEGFC的受体为VEGFR2和VEGFR3，尽管两种受体在血管和淋巴管都有表达，但是VEGFR3主要位于淋巴管内皮细胞，而且VEGFC与VEGFR3结合的亲和力比VEGFR2要高的多，所以VEGFC更多地表现出促进淋巴管生成与扩张〔3〕。本研究表明，伴有颈部淋巴结转移的喉癌，其VEGFC阳性表达显著高于无淋巴转移者，提示VEGFC阳性表达与喉癌的淋巴结转移关系密切。目前大多数研究认为恶性肿瘤中VEGFC表达增加并促进淋巴转移是因为恶性肿瘤细胞产生VEGFC，并通过下述途径参与调节淋巴管的增生及其通透性等而更易浸润至淋巴管内，从而导致淋巴转移：(1)通过激活淋巴管内皮细胞上VEGFR3受体，刺激淋巴管内皮增生，诱导癌周淋巴管增生，并降低淋巴管内皮细胞间的黏附，提高淋巴管通透性，增加了肿瘤淋巴转移机会〔4〕 ;(2)提高肿瘤细胞黏附作用：分泌VEGFC 的肿瘤细胞通过淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR3 的亲合作用，使肿瘤细胞特异地黏附到淋巴管内皮细胞上〔5〕。

　　本研究发现，在喉癌淋巴结转移组CXCR4与VEGFC的阳性表达率均显著高于淋巴结无转移组，而且CXCR4与VEGFC之间表达呈正相关，说明两者可能在喉癌淋巴结转移中起协同作用。研究发现，VEGFC既可以促进淋巴内皮细胞的增生，又可促进淋巴内皮细胞产生趣化因子，诱导肿瘤细胞向特定的器官转移〔6〕。另又研究表明，CXCR4和VEGFC均可通过PI3 Akt和MEK/ERK途径激活下游信号分子，促进淋巴转移〔7,8〕，并且，淋巴管内皮生长刺激因子VEGFC及其受体VEGFR3的信号通路与CXCL12/CXCR4信号通路之间可能存在着交叉对话〔9,10〕。因此我们推测在它们的共同作用下，喉癌细胞向淋巴管定向迁移的渗透能力增强，这样癌细胞更容易通过淋巴管转移至局部淋巴结并形成转移灶，但具体的分子机制还不清楚，有待于进一步研究。

　　【参考文献】

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　　9 Karpanen T，Makinen T.Regulation of lymphangiogenesis from cell fate determination to vessel remodeling〔J〕.Exp Cel Res，2006;312(5)：57583.

　　10 J AI Rawi MA，Mansel RE，Jiang WG.Molecular and cellular mechanisms of lymphangiogenesis〔J〕.Euro J Surg Oncol，2005;31(2)：11721.