骨桥蛋白与尿激酶型纤溶酶原激活物在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义

　　作者：张中华，梁昆，马超，雷大鹏，潘新良 作者单位：1. 山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉-头颈外科， 2. 山东大学卫生部耳鼻喉科学重点实验室， 济南 250012

　　【摘要】 目的 探讨骨桥蛋白(OPN)和尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其与喉癌侵袭、转移的关系。方法 应用免疫组织化学方法检测64例喉癌组织、18例癌旁正常黏膜中OPN和uPA的表达，从部位、分化程度、临床分期、淋巴结转移等不同方面分别进行对照分析，比较其有无差异。 结果 64例喉癌组织中OPN与uPA蛋白的阳性表达率分别为62.5%(40/64)、65.6%(42/64)。OPN与uPA的表达与肿瘤组织临床病理分期和有无淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者年龄、性别、肿瘤的部位及分化程度等无关(P>0.05)，且二者表达呈正相关(r=0.6625,P<0.05)。 结论 OPN和uPA基因蛋白在喉癌的侵袭转移过程中起着重要作用，有望成为反映喉癌生物学特性及评价预后的重要标记分子。

　　【关键词】 喉肿瘤;骨桥蛋白;尿激酶型纤溶酶原激活物;免疫组化;侵袭转移

　　ZHANG Zhonghua1, LIANG Kun1, MA Chao2, LEI Dapeng1, PAN Xinliang1

　　(1. Department of Otorhinolaryngology & Head and Neck Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China;

　　2. Key Laboratory of Otorhinolaryngology, Ministry of Health, Shandong University, Jinan 250012, China)

　　To investigate expressions of osteopontin (OPN) and urokinasetype plasminogen activator(uPA) and their relation to the invasiveness and metastasis of squamous cell carcinoma of the human larynx. Methods Expressions of OPN and uPA in 64 cases of laryngeal carcinoma tissue and 18 cases of adjacent normal tissue were detected by using an immunohistochemistry method. Differences of age, sex, differentiation degree, clinical stage and lymphatic metastasis were analyzed. Results In 64 cases of laryngeal carcinoma tissues, the positive expression rates of OPN and uPA were 62.5%(40/64) and 65.6% (42/64) respectively ,which were obviously higher than those in adjacent normal tissues(P<0.05).　Expressions of OPN and uPA in carcinoma tissues were related to clinical pathological stage and lymphatic metastasis(P<0. 05), but not related to age, sex or differentiation degree (P>0. 05). Expression of OPN was positively correlated with that of uPA in laryngeal carcinoma tissues(r=0.6625, P<0.05). Conclusion Expressions of OPN and uPA can reflect biological characteristics of laryngeal carcinoma and could be used as important molecular markers in the prognosis of laryngeal carcinoma.

　　Key words: Laryngeal neoplasms; Osteopontin; Urokinasetype plasminogen activator; Immunohistochemistry; Invasiveness and metastasis

　　喉癌是喉部最常见的恶性肿瘤，喉鳞状细胞癌约占全部喉恶性肿瘤的90%以上，其发病率近年来有明显增长的趋势，并与多种因素密切相关。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是细胞外基质中具有多种生物学活性的分泌型磷酸化糖蛋白，作用于肿瘤发生发展转移的多个环节，与肿瘤细胞的生长、侵袭、转移密切相关，被称为肿瘤转移相关基因[1]。尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinasetype plasminogen activator，uPA)为丝氨酸蛋白酶类，通过降解肿瘤细胞周围的基质和基膜成分以及启动细胞信号，参与肿瘤组织血管形成,在肿瘤的侵袭和转移过程中起着重要的作用[2]。近年来，有关OPN及uPA与肿瘤的关系成为研究的热点,已发现多种肿瘤组织中高表达OPN和uPA。本研究采用免疫组织化学方法检测OPN和uPA在喉癌组织中的表达,分析二者在喉癌发病中的意义及相互关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本 选择2007年3月至2008年7月间， 山东大学齐鲁医院耳鼻喉科施行手术切除并经病理证实为喉鳞状细胞癌的患者64例， 其中男56例， 女8例， 37～74岁， 平均63岁， 术前均未经放射或化学治疗; 声门上型喉癌20例，声门型44例; 按1997年UICC TNM分期分级标准,临床分期： Ⅰ期3例，Ⅱ期19例，Ⅲ期28例，Ⅳ期14例。按肿瘤组织分化程度分：高分化38例，中分化15例，低分化11例;有淋巴结转移者24例，无淋巴结转移者40例。另取18例癌旁距肿瘤1cm正常黏膜作为对照。 标本直接采自手术切除物，所有标本在手术离体后立即去掉坏死组织、血块， 经甲醛溶液固定， 常规石蜡包埋。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂 鼠抗人OPN(AKm2A1)单克隆抗体(sc21742)、兔抗人uPA(H140)单克隆抗体(sc14019)均购自美国Santa Cruz生物科技公司, SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司。

　　1.2.2 免疫组化 所有蜡块标本经5μm连续切片，用于HE染色和免疫组织化学染色。免疫组织化学检测SP法，抗OPN和抗uPA均按1∶150稀释。整个过程按试剂盒说明书进行，经过烤片、二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、抗原修复、羊血清工作液封闭、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜、滴加生物素标记二抗、DAB显色、苏木素复染、常规脱水、干燥、封片等主要步骤。每批染色均以已知阳性片作阳性对照,用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

　　1.2.3 结果判读 采用双盲法，由两位医师独立观察每张切片后一起做出判断。阳性结果判断标准根据以下两个方面[3]，①按切片中显色细胞百分率计分。O分：无细胞显色，1分：显色细胞百分率<25%，2分：显色细胞百分率25%～50%，3分：显色细胞百分率>50%;②按切片中癌细胞显色强度计分。0分：细胞无显色，1分：呈浅黄色，2分：呈棕黄色，3分：呈棕褐色。两项评分之和>3分记为阳性，≤3分记为阴性。

　　1.3 统计学处理 均用SPSS13.0分析软件。采用χ2检验和Spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 OPN和uPA在喉癌组织中的表达 在肿瘤组织OPN和uPA表达阴性切片， 癌巢中几无阳性染色(见图1和图2)。在阳性切片中， OPN阳性颗粒主要位于癌细胞的细胞浆内, 弥散分布于癌巢中， 呈棕黄色(图3); uPA主要表达于肿瘤细胞膜或胞浆中，呈弥漫性着色(图4)。64例喉癌标本中OPN、uPA蛋白染色阳性率分别为62.5%(40/64)、65.6%(42/64) ;18例正常组织中OPN、 uPA蛋白染色阳性率分别为11.1%(2/18)、0(0/18)。二者比较，χ2值分别为14.849和24.216， P<0.05， 差异有统计学意义。

　　图 1 OPN在喉癌组织中的阴性染色(SP法 ×400)图 2 uPA在喉癌组织中的阴性染色(SP法 ×400)图 3 OPN在喉癌组织中的阳性染色(SP法 ×400) 图 4 uPA在喉癌组织中的阳性染色(SP法 ×400)表 1 喉癌组织中OPN及uPA蛋白的表达与临床病理特征的关系

　　2.2 喉癌组织中OPN与uPA蛋白表达的相关性分析 见表2。应用Spearman相关分析，OPN与uPA在喉癌组织中的表达呈正相关(r=0.663，P<0.05)。

　　3 讨 论

　　喉癌中男性发病率较女性高，近几年来有明显的增高趋势。其成为人类致命疾病的原因，不仅在于癌细胞的生长失去控制,更在于其具有转移能力。转移是恶性肿瘤的晚期表现和癌症死亡的主要原因，也是实质性肿瘤难以治愈的原因[4]。目前，喉癌转移的具体机制尚未明了。因此研究喉癌转移的机制，针对其中的某些环节进行干预可能成为喉癌治疗的新策略。

　　OPN是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸残基的磷酸化酸性糖蛋白分子,相对分子量约325000。其基因表达具有组织细胞特异性,可以促进肿瘤细胞的趋化、黏附和迁徙,近年来的大量研究表明，OPN在肿瘤发生发展特别是在肿瘤侵袭和转移过程中具有重要作用[5]。Coppola等[6]采用免疫组化的方法在胃癌、大肠癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌中均检测到OPN的过度表达，并认为OPN的表达与肿瘤的分期及其特定部位相关，如乳腺、结肠、喉头部、口腔、唾液腺等。提示OPN在人体不同肿瘤组织中广泛表达，参与肿瘤的形成，且OPN在肿瘤的侵袭与转移中起到一定作用。付维等[7]应用免疫组化SP法及RTPCR方法对40例喉鳞状细胞癌及癌旁相对正常组织标本中的OPN表达进行了检测和研究，结果发现，OPN在癌组织中有较高表达，而且OPN的表达程度与肿瘤的临床分期、病理学分级和淋巴结转移情况有关。本研究中OPN在喉癌组织中的表达率为62.5%，而癌旁组织中OPN的表达率为11.1%,两者有显著差异(P<0.05);Ⅲ～Ⅳ期喉癌组织中OPN的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期，并且有淋巴结转移组的OPN表达水平明显高于无淋巴结转移组，提示OPN表达与喉癌的侵袭和发展有关(P<0.05)，而与患者年龄、肿瘤的部位无关(P>0.05)，此与前者研究结果相同。而本研究显示OPN在癌组织中的表达与肿瘤组织分化程度无关(P>0.05)，这与前者的研究结果不一致，可能是由于研究方法、实验条件不同以及统计方法不同所导致。

　　肿瘤的浸润和转移是多步骤、多阶段的过程，涉及肿瘤细胞穿过细胞外基质屏障,血管的基底膜及穿出血管壁进入宿主其他部位的过程。uPA是由内质网膜系统合成的一种高度特异的丝氨酸蛋白水解酶，与其特异性受体结合后能使纤溶酶原激活成纤溶酶,后者能降解细胞外基质和基底膜成分,如纤维蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等,这种蛋白降解作用最终导致肿瘤细胞发生侵袭和转移[8]。王大力等[9]研究发现，uPA及其受体在喉癌组织中呈正相关表达，在肿瘤的浸润转移过程有协同和相互调节的作用，并且二者表达水平越高，患者发生颈部淋巴结转移的倾向越高，预后就越差。本研究显示，uPA在喉癌组织和癌旁组织中的表达率分别为65.6%和0%，两者差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ～Ⅳ期喉癌组织中uPA的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移组的uPA表达水平明显高于无淋巴结转移组，提示uPA表达与喉癌的侵袭和发展有关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤部位及分化程度等无明显相关性(P>0.05)。

　　喉癌的发生和发展是一个多因素多基因参与的复杂过程。近来的研究发现[10]，OPN能诱导肿瘤细胞中PI3 K/AKt依赖的NFKB的激活和uPA的分泌,也能通过IKK/ERK途径诱导NIK依赖的NFKB的激活,刺激uPA依赖的MMP9的活化。uPA分泌增多，不仅本身可以降解细胞外基质，而且与其受体结合后激活纤溶酶原系统，引发更强烈的蛋白水解活动，从而使肿瘤细胞的运动能力增强，促进其侵袭转移。在本实验中，OPN与uPA两种蛋白在喉癌组织中共同阳性表达率为56.25%，并成正相关表达(P<0.05)，提示二者在喉癌的发生和发展过程中存在协同作用。检测喉癌组织中OPN和uPA的表达情况可作为反映喉鳞状细胞癌生物学行为的客观参考指标，有助于了解喉癌浸润转移的倾向，并为选择术式和判断预后提供依据。由于本实验研究未将声门下型等临床少见类型喉癌列入研究对象，以及实验方法上的局限，OPN和uPA的联合检测在喉癌的诊断和治疗方面的意义及可能的应用前景，仍需进一步研究证实。

　　【参考文献】

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　　[3] Kita Y, Natsugoe S, Okumura H, et al. Expression of osteopontin in oesophageal squamous cell carcinoma[J]. Br J Cancer, 2006, 95(5):634638.

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　　[6] Coppola D, Szabo M, Boulware D, et a1.Correlation of osteopontin protein expression and pathological stage across a wide variety of tumor histologies[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10(1):184190.

　　[7]付维，范尔钟，杨征，等.骨桥蛋白在喉癌组织中的表达[J].中国耳鼻咽喉头颈外科，2008，15(4):201205.

　　[8] Shariat S F, Roehrborn C G, McConnell J D, et al. Association of the circulating levels of the urokinase system of plasminogen activation with the presence of prostate cancer and invasion, progression, and metastasis[J]. J Clin Oncol，2007， 25(4):349355.

　　[9] 王大力，王铁. 尿激酶型纤溶酶原激活剂及其特异受体在喉癌中的表达及意义[J]. 临床耳鼻咽喉科杂志，2005，19(12)：529531.