抑癌基因PTEN在鼻咽癌中的表达及突变

　　作者：程金妹，谢振宇，林勤 作者单位：1. 福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科, 福州 350005; 2. 福建医科大学基础医学院病理学系， 福州 350004

　　【摘要】 了解抑癌基因PTEN在鼻咽癌中的表达、突变情况，探讨其与鼻咽癌发生发展的关系。方法 采用免疫组化检测52例鼻咽癌中PTEN基因的表达，利用PCRSSCP银染、DNA测序分析等方法检测PTEN基因第5、8外显子突变。结果 鼻咽癌中PTEN蛋白表达率低于癌旁组织，表达与临床TNM分期、颈部淋巴结转移密切相关(P<0.05)。52例鼻咽癌中PTEN基因第5、8外显子未见明显突变。结论 抑癌基因PTEN可能参与鼻咽癌的发生发展，其第5、8外显子在鼻咽癌的发生发展中可能不起关键作用。

　　【关键词】 鼻咽肿瘤 基因 PTEN 点突变 免疫组织化学

　　CHENG Jinmei1, XIE Zhenyu1, LIN Qin1, ZHANG Pengfei2, LIN Ying1, YI Zixiang1， TIAN Weizhong2

　　(1. Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China;

　　2. Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University， Fuzhou 350004， China)

　　To detect the expression and mutation of tumor suppressor PTEN in nasopharyngeal carcinoma(NPC)， and to　investigate the relationship of the PTEN gene to pathogenesis and development of NPC. Methods Expression levels of PTEN in 52 cases of NPC were determined by an immunohistochemistry method， and polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism (PCRSSCP), while silver staining and DNA sequencing were used to detect the mutation in exon 5 and 8 of the PTEN gene in NPC. Results Differences of the PTEN expression were significant between NPC and nasopharyngitis (P<0.05). Expressions of PTEN were closely related to lymph node metastasis and clinical TNM stage(P<0.05). None of 52 cases showed mutation in exon5 and 8 of the PTEN gene in NPC. Conclusion PTEN may have some effects on the pathogenesis and development of NPC, and mutation in exon 5 and 8 of PTEN may not play a main role in the genesis and development of NPC.

　　Key words： Nasopharyngeal neoplasms; Genes， PTEN; Point mutation; Immunohistochemistry 鼻咽癌早期症状不特异，易误诊致延误治疗。我们采用免疫组化检测52例鼻咽癌组织中PTEN基因的表达，利用PCRSSCP银染、DNA测序分析等方法检测PTEN基因第5、8外显子突变，探讨PTEN基因与鼻咽癌发生发展的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 52例鼻咽癌标本均来自我院耳鼻咽喉科2005年1月至2006年8月间收集的活检标本，全部患者均未接受放疗及化疗;其中男41例，女11例，22～76岁，平均46岁。病理类型均为鼻咽鳞癌，其中低分化47例，中-低分化5例。以鼻咽癌分期法(国际抗癌联盟UICC 2003版)为标准，I～Ⅱ期17例，Ⅲ～Ⅳ期35例;有颈淋巴结转移33例，无颈淋巴结转移19例。另取20例经病理证实为非肿瘤组织的癌旁组织作对照。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 DNA提取、PCR扩增及电泳 采用组织基因组DNA提取试剂盒(Tiangen公司，北京)，严格按照试剂盒操作流程提取，产物-20℃保存。分别按照李长青等[1]报告的方法合成PTEN基因第5、8外显子引物(Sangon公司，上海)。25μL体系常规PCR扩增：12.5μL PCR混合液，上下游引物各1μL，DNA模板1μg，双蒸水补足。PCR扩增条件：先94℃预变性5 min，94℃变性1min， 53℃退火45s，72℃延伸1min,进行35个循环,末次循环于72℃延伸5min。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带。

　　1.2.2 SSCP银染、DNA胶回收及测序分析 分别采用含尿素的8%、10%及12%的PAG胶，常规灌胶，室温聚合2h。取5μL PCR产物与5μL上样缓冲液混匀，PCR扩增仪上98℃变性10min后，冰浴5min;立即加样于凝胶中电泳。电泳条件:1×TBE电泳缓冲液，室温25℃左右，稳压150V，电泳6h。电泳后常规银染。每个标本在三种PAG胶浓度下各进行至少2次的检测，以保证结果的重复性。对上述可疑突变标本进行DNA胶回收纯化后送生物试剂公司测序证实。

　　1.2.3 免疫组化染色 所有标本经常规HE切片证实，石蜡切片厚度为5μm。采用免疫组化SP法，一抗兔抗人PTEN多克隆抗体(中杉金桥公司，北京)为即用型。严格按超敏免疫组化SP试剂盒(迈新公司，福州)操作流程染色，DAB显色。分别以已知阳性片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3 结果判定

　　1.3.1 PTEN基因突变判定标准 以癌旁组织标本作对照，若出现条带位置的异常或条带数的增减则认为突变，测序证实。若均未见条带异常，则随机抽取若干个肿瘤标本送生物试剂公司测序进一步验证。

　　1.3.2 PTEN蛋白阳性表达判定标准 用高倍镜(×400)检测每张切片的10个代表性区域，每个区域计算100个细胞;然后计算染色细胞百分率，阳性染色者在细胞浆有棕黄色颗粒沉着，根据细胞浆染色程度以及染色细胞百分率进行分析评分：0分(基本不着色者)、1分(着色淡者)、2分(着色适中者)、3分(着色深者);着色细胞占计数细胞百分率：0分(≤5%)、1分(6%～25%)、2分(26%～50%)、3分(≥51%)。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分各自相乘，为其最后得分。得0～1分为阴性(-);得2分及以上为阳性(+)。

　　1.4 统计学处理 采用Fisher确切概率法，进行χ2、t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 PCR扩增结果 52例鼻咽癌中PTEN基因第5、8外显子序列均扩增成功(图1)。PCRSSCP银染检测结果52例鼻咽癌中PTEN基因第5、8外显子均未见明显突变(图2)。随机抽取10个肿瘤标本测序，报告回报与银染结果一致。

　　2.2 PTEN蛋白表达 主要表达于细胞胞浆，少数位于细胞核(图3、4)。鼻咽癌中PTEN蛋白表达率为44%(23/52)，癌旁组织中PTEN蛋白表达率为80%(16/20)，两者差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅰ～Ⅱ期鼻咽癌PTEN蛋白阳性表达率高于Ⅱ～Ⅳ期;鼻咽癌中伴有淋巴结转移的PTEN蛋白表达率明显低于不伴有淋巴结转移的(表1)。

　　3 讨 论

　　PTEN基因是是继P53基因之后发现的又一重要抑癌基因，关于PTEN基因在肿瘤中的突变频率报道不一。多数学者认为在子宫内膜癌、前列腺癌、晚期胶质瘤中突变率较高，在其他多数肿瘤中突变率不高甚至很低。

　　我们采用PCRSSCP银染和DNA测序分析，对鼻咽癌中PTEN基因突变高发区第5、8外显子进行检测，均未见明显突变。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为目的条带，表明标本存在问题的可能性可排除。采取三种PAG胶浓度对同一标本检测，尽量避免阴性结果的存在。另外，对同一标本在三种PAG胶浓度下各进行至少2次的检测，保证实验结果的重复性。故此，实验设计及人为因素造成的假阴性概率很小，实验结果可靠。我们还发现，鼻咽癌中PTEN蛋白表达明显低于癌旁组织，表明PTEN基因可能与鼻咽癌的发生有关。Ⅰ～Ⅱ期鼻咽癌PTEN蛋白阳性表达高于Ⅱ～Ⅳ期，且伴有淋巴结转移的PTEN蛋白表达率明显低于不伴有淋巴结转移者，提示PTEN蛋白可能参与鼻咽癌的发展，且在鼻咽癌中有失表达或表达减少的现象[2]，推测PTEN基因水平的改变可能存在翻译或翻译后水平的调控机制。

　　肿瘤的发生发展是多因素、多步骤、多阶段和多基因改变的过程。PTEN基因9个外显子均可发生突变;以第5、8外显子多见，而核心磷酸酶区域位于第5外显子，第8外显子中含2个潜在的酪氨酸磷酸酶位点和1个丝氨酸磷酸酶位点。故我们推测，PTEN基因突变导致PTEN基因的去磷酸化，使PTEN基因的抑制肿瘤功能降低或丧失。我们研究发现，52例散发性鼻咽癌中未有明显的PTEN基因第5、8外显子突变，因此认为PTEN基因第5、8外显子在鼻咽癌发生发展中可能不起关键作用。这和一些学者在其他肿瘤中的研究结果类似。Sakurada等[3]研究了20例卵巢癌的PTEN突变，未检测到突变; Feilotter等[4]在70例散发乳腺癌患者中均未检测到PTEN突变，提示在乳腺癌发生中PTEN可能不是起主要作用的靶基因。Hsieh等[5]对17例甲状腺肿瘤标本中PTEN 基因的9个外显子进行直接序列分析，未发现突变。Orikasa等[6]对45例该国患者原发性前列腺癌标本的检测表明，没有1例原发性前列腺癌患者发生PTEN基因的突变;故认为PTEN基因突变在日籍患者的前列腺癌发生过程中不起主要作用。张宏艳等[7]对45例乳腺癌组织PTEN基因9个外显子进行突变检测，仅发现1例第2外显子错义突变，即在第5、8外显子也未发现PTEN突变。在此，我们仅对PTEN基因部分突变高发区域进行研究，故与鼻咽癌的确切关系仍需进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] 李长青,金春顺,辛丁,等.喉鳞癌PTEN基因第5、8外显子的测序分析[J].中国眼耳鼻喉科杂志，2005，5(1)：911.

　　[2] 崔朝阳,程金妹,张鹏飞,等.抑癌基因PTEN、P^21wafl在鼻咽癌中的表达及意义[J].耳鼻咽喉：头颈外科，2003，10(2)：102106.

　　[3] Sakurada A, Suzuki A, Sato M, et al. Infrequent genetic alterations of the PTEN/MMAC1 gene in Japanese patients with primary cancers of the breast, lung, pancreas, kidney, and ovary[J]. Jpn J Cancer Res, 1997, 88:10251028.

　　[4] Feilotter H E, Coulon V, McVeigh J L, et al. Analysis of the 10q23 chromosomal region and the PTEN gene in human sporadic breast carcinoma[J]. Br J Cancer, 1999, 79:718723.

　　[5] Hsieh M C, Lin S F, Shin S J, et al. Mutation analysis of PTEN/MMAC 1 in sporadic thyroid tumors[J]. Kaohsiung J Med Sci, 2000, 16:912.

　　[6] Orikasa K, Fukushige S, Hoshi S, et al. Infrequent genetic alterations of the PTEN gene in Japanese patients with sporadic prostate cancer[J]. J Hum Genet, 1998, 43:228230.

　　[7] 张宏艳，李刚，宋三泰，等.乳腺癌组织PTEN基因突变的PCRSSCP分析[J].解放军医学杂志，2006，31(9)：885886.