脑缺血耐受大鼠促红细胞生成素和缺氧诱导因子1α的表达及其相关性

脑缺血耐受大鼠促红细胞生成素和缺氧诱导因子1α的表达及其相关性作者：孙忠玲,赵仁亮,董瑞剑    作者单位：266003青岛大学医学院附属医院神经内科（孙忠玲,赵仁亮）；淄博市中心医院（董瑞剑）    【摘要】  目的 研究脑缺血预处理诱导脑缺血耐受大鼠促红细胞生成素（EPO）及缺氧诱导因子（HIF1α）的表达及其相关性。方法 采用二次线栓法制作大鼠脑缺血预处理与缺血再灌注模型（预缺血组），分别在短暂预缺血后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d行脑缺血再灌注处理。用TTC染色测定脑梗死体积；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测大鼠脑内EPO mRNA 、HIF1α mRNA的表达；并与无缺血预处理组（无预缺血组）比较。结果 预缺血组1 d、3 d、7 d亚组的脑梗死体积较无预缺血组明显减小（均P<0.05) 。预缺血组3 d、7 d亚组大鼠脑EPO mRNA、HIF1α mRNA表达明显高于无预缺血组的相应各亚组（均P<0.05)；两组1 d、14 d、21 d亚组的差异无统计学意义。EPO mRNA与HIF1α mRNA的表达呈正相关(r=0.737,P<0.01)。结论 缺血预处理可使EPO及HIF1α表达在脑缺血后明显增高，两者的表达呈正相关。这可能是缺血预处理诱导脑缺血耐受形成的机制之一。    【关键词】  缺血预处理；缺血耐受；脑缺血；促红细胞生成素；缺氧诱导因子1α    Expression and correlation between erythropoietin mRNA and hypoxia inducible factor1α mRNA in rats with brain ischemic tolerance  SUN Zhongling,ZHAO Renliang,DONG Ruijian.Department of Neurology,the Affiliated Hospital of Medical College,Qingdao University,Qingdao 266003,China    Abstract：Objective  To research the expression and correlation between erythropoietin (EPO) mRNA and hypoxia inducible factor1α(HIF1α) mRNA in rats with brain ischemic tolerance induced by ischemic preconditioning.Methods  Models of cerebral ischemic preconditioning and ischemicreperfusion (preconditioning group) were made by twice suture method, after the short ischemic preconditioning 1 d, 3 d, 7 d, 14 d and 21 d respectively,the models were underwent ischemicreperfusion again. The infarct volume was measured by tetrazolium chloride (TTC) staining, the expressions of  HIF1α mRNA and  EPO mRNA in the different time (1～21 d) of ischemicreperfusion  were detected by  reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR) and compared with nonpreconditioning group.Results  The infarct volume in the 1 d,3 d and 7 d subgroups of preconditioning group were significantly smaller compared with nonpreconditioning group（all P<0.05). The expressions of EPO mRNA and HIF1α mRNA in the 3 d ,7 d subgroups of preconditioning group  had a distinct increase compared with nonpreconditioning group（all P<0.05); while in the 1 d,14 d,21 d subgroups,they had no different.There was positive correlation between the expressions of EPO mRNA and HIF1α mRNA (r=0.737,P<0.01).Conclusions  Ischemic preconditioning can increase the expressions of EPO mRNA and HIF1α mRNA in early time of cerebral ischemia, and there is the  positive correlativity betwen the expressions of EPO mRNA and HIF1α mRNA.This may be one of the possible mechanisms of cerebral ischemic tolerance by ischemic preconditioning.    Key words：ischemic preconditioning;ischemic tolerance;cerebral ischemia;erythropoietin;hypoxia inducible factor1α    研究［1,2］证实，一次或多次（2、3次）短暂性脑缺血预处理，可减轻其后发生缺血的脑组织的病变程度，即诱发了脑缺血耐受。近年来研究［3,4］发现，促红细胞生成素(EPO)可在中枢神经系统表达，具有神经保护作用。缺氧诱导因子1α（HIF1α）是一种普遍存在的氧敏感性转录调节因子，EPO的表达受HIF1α的调控。本研究观察缺血预处理后缺血再灌注大鼠脑部EPO及HIF1α表达的变化及其相关性，以探讨缺血预处理诱导脑缺血耐受的机制。1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  实验动物和分组  健康雄性Wistar大鼠 99只，质量250～300 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。自然喂养，随机分成3组：（1）缺血预处理组（预缺血组，45只）：又按预缺血后的不同时间分成1 d, 3 d, 7 d, 14 d和21 d 5个亚组，每组9只；（2）无缺血预处理组（无预缺血组，45只）：按同样时间点分成5个亚组；(3)假手术组(9只)。    1.1.2  主要仪器与试剂  逆转录聚合酶链反应（RTPCR）反应仪（ EppendorfNethelerHinzGmbH,Germany）；电泳仪 （PowerSupply PAC300 BIPRAD）；紫外线凝胶成像分析仪（VILBER LOURM，USA）；紫外分光光度计 （DUR640BECKMAN,USA）；Trizol RNA 提取试剂盒及RTPCR Kit （德国QIAGEN公司）。    1.2  方法    1．2．1  预缺血及缺血再灌注模型制作  参照Longa等［5］报道的方法略加改进。10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，颈部正中偏左切口，暴露左侧颈总动脉（CCA） 分叉处，阻断颈内动脉（ICA），于颈外动脉（ECA）距离分叉5 mm处剪0.2 mm小口，线栓插入后经分叉进入ICＡ，插入深度（18.5±2）mm， 10 min后退出线栓至ＥCＡ，并埋于皮下，完成缺血预处理。在缺血预处理后预定时间点再次麻醉大鼠，将埋在皮下的线栓推进ICA再次造成动脉堵塞，2 h后拔出线栓，形成再灌注。以动物清醒后出现左前肢不能伸展，爬行时向左侧转圈，并存活至规定的时间点为造模成功。无预缺血组第1次只分离、暴露CCA，不插线栓；以后处理同预缺血组。假手术组仅暴露CCA及分叉处,不作其他处理。    1．2．2  脑梗死体积测定  缺血再灌注后22 h，每组随机选取4只大鼠，乙醚麻醉后快速断头取脑，距额极2 mm向后连续等距切取5个冠状脑片，间距2 mm，用TTC染色法。正常组织染成红色，梗死灶染成白色。梗死体积=各层梗死面积之和×层间隔。    1.2.3  EPO mRNA和HIF1α mRNA表达检测  不同时点各组取5只大鼠麻醉后断头取脑，置于-20℃冰箱约5 min，剥取左侧大脑半球距离嗅球尖端8～11 mm之间额顶上部皮质，置组织于RNA guard -20℃冰箱保存。采用RTPCR检测EPO mRNA和HIF1αmRNA的表达。反应结束后，分别取3 μl PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像。用BioRad图像分析软件进行吸光度容量定量分析，PCR产物的相对量=EPO（or HIF1α）扩增产物的吸光度值/βactin扩增产物的吸光度值。    1.2.4  统计学方法  检测数据采用均值±标准差(±s)表示。各组之间比较采用t检验，组内不同时间点之间比较采用单因素方差分析， 相关性采用Pearson相关分析。应用SPSS 11.5软件包进行统计学处理。2  结  果    2.1  各组脑梗死体积比较  假手术组TTC染色脑组织呈现均匀红色，无梗死灶。预缺血组与无预缺血组脑组织均见白色缺血灶，主要位于额、顶、颞叶皮质以及海马区。其中，预缺血组1 d、3 d、7 d亚组梗死体积较无预缺血组相应各亚组的梗死体积明显减小（均P<0.05)；而两组14 d、21 d亚组之间差异无统计学意义。预缺血组3 d、7 d组梗死体积最小，1 d、3 d、7 d亚组与21 d亚组比较差异有统计学意义（均P<0.05)。见表1。    2．2  Epo mRNA、HIF1α mRNA的表达及其相关性预缺血组3 d、7 d亚组脑组织EPO mRNA和HIF1α表达量显著高于无预缺血组（均P<0.05）。见表2、3。Pearson相关分析显示，EPO mRNA与HIF1α mRNA的表达呈正相关（r=0.737，P<0.01)。表1  预缺血组与无预缺血组不同时间点脑梗死体积比较 注：与无预缺血组比较*P<0.05；与同组21 d亚组比较△P<0.05  表2  预缺血组与无预缺血组不同时间点脑组织EPO mRNA表达的比较注：与无预缺血组比较*P<0.05；与组内不同时间亚组比较△P<0.05表3  预缺血组与无预缺血组不同时间点脑组织HIF1α mRNA表达的比较 注：与无预缺血组比较*P<0.05；与组内不同时间亚组比较△P<0.053  讨  论    脑缺血预处理能诱导脑缺血耐受，国内外研究已有很多，但其具体机制目前尚不清楚。    HIF1α是近年发现的一种氧敏感性转录调节因子，与神经系统损伤、肿瘤、肺动脉高压等疾病密切相关，对缺氧缺血具有特异敏感性，对机体维持体内氧稳态具有重要意义。近年来研究表明， HIF1与脑缺血关系密切，在缺血缺氧性脑损伤中发挥极其重要的作用。Sharp等［6］研究发现,局灶性脑缺血后7.5 ｈ,mRNA编码的HIF1α、葡萄糖载体蛋白1（GT1）及一些糖酵解酶在梗死周边区开始诱导出现,19 ｈ及24 ｈ时其表达进一步上调；可能由于半暗带的脑血流量下降,减少了该区的氧供,从而诱导HIF1α及其靶基因的产生。Bergeron等［7］研究也认为，在急性局灶性脑缺血时HIF1α及其相关基因表达上调促进了梗死灶周边血管网的重塑和糖酵解，有助于缺血脑组织的存活。    EPO是受缺氧调节的糖蛋白类激素，过去认为是由胎肝和肾脏产生的造血因子。近来研究表明，在缺血、缺氧条件下，中枢神经系统可检测到脑源性EPO的表达，且有大量证据提示EPO具有神经活性。Dawson［8］提出脑缺血预适应的效应可能是EPO介导的。Bernaudin等［9］研究发现，脑缺氧预适应与脑源性EPO的表达密切相关，小鼠局灶性持续性脑缺血12 h，在梗死灶核心区未见EPO阳性细胞，12 h以后，在梗死灶周边区域可见EPO阳性神经元和星形胶质细胞，这与脑缺血耐受在时程上具有相关性。EPO受体（EPOR）不仅可以在胶质细胞中检测到，而且也在海马和皮质的神经细胞中发现［10］。这些发现提示EPO通过一种旁分泌的方式作用于神经元，对局灶性和全脑梗死有保护作用。    目前，大鼠局灶性缺血预处理诱导脑缺血耐受后HIF1α、EPO表达的研究报道较少。本实验采用RTPCR检测缺血预处理不同时间缺血再灌注大鼠脑内EPO mRNA、HIF1α mRNA的表达，用TTC染色测定脑梗死体积，对缺血预处理诱导脑缺血耐受的形成机制进行了探讨。结果显示，预缺血后1～7 d大鼠脑梗死体积比相应时间无预缺血处理大鼠脑梗死体积明显减小。预缺血后3～7 d大鼠脑EPO mRNA、HIF1α mRNA表达明显高于无预缺血组的相应各亚组；两组1 d、14 d、21 d亚组的差异无统计学意义。EPO mRNA与HIF1α mRNA的表达呈正相关。    脑缺血时EPO的表达与HIF1的表达密切相关，可能在于EPO为HIF1的下游靶基因 之一。HIF1 由α、β两个亚基组成 ，HIF1α既是 HIF1 调节亚基，又是活性亚基， HIF1 活性调节主要通过对该亚基的影响实现。缺氧时 HIF1 两个亚基形成二聚体，可与许多靶基因的低氧反应元件结合，调节其表达，介导机体的缺氧反应，在缺氧诱导的基因表达中起到关键作用。HIF1的靶基因主要包括EPO、血管内皮生长因子(VEGF)、葡萄糖载体蛋白1(GT1)和糖酵解酶等。在缺血缺氧条件下，脑组织局部很快出现HIF1，HIF1进入细胞核与HIF1反应元件结合，启动EPO基因转录。但HIF1α并不是调控EPO生成的惟一因子，文献［11］报道VEGF也可诱导EPO的生成。    总之，本实验结果显示，缺血预处理诱导了脑缺血耐受，EPO、HIF1α在预处理后产生脑缺血耐受的相应时间窗内表达增加，提示二者可能是参与脑缺血耐受形成的重要分子。但二者的表达时间与缺血预处理产生脑缺血耐受的时间并不完全一致,提示可能尚有其他因素参与脑缺血耐受,值得进一步探讨。【参考文献】  ［1］Kitagawa K,Matsumoto M,Tagaya M,et al.“Ischemic tolerance” phenomenon found in the brain［J］.Brain Res,1990,528:21.  ［2］邓艳秋，赵纲，王建枝.脑缺血预处理与脑缺血耐受的研究进展［Ｊ］.临床神经病学杂志,2005,18:155.  ［3］Marti HH,Bernaudin M,Petit E,et al.Neuroprotection and angiogenesis:dual role of erythropoietin in brain ischemia［J］.Physiol Sci,2000,15:225.  ［4］Bernaudin M,Marti HH,Roussel S,et al.A potential role for erythropoietin in focal permanent cerebral ischemia in mice［J］.J Cereb Blood Flow Metab,1999,19:643.  ［5］Longa 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