局部亚低温对大鼠脑缺血后凋亡细胞及谷氨酸转运体、亲代谢型谷氨酸受体表达的影响

局部亚低温对大鼠脑缺血后凋亡细胞及谷氨酸转运体、亲代谢型谷氨酸受体表达的影响作者：张欣，汤颖，王安宁，王德生    作者单位：哈尔滨医科大学第一临床医学院神经内科    【摘要】  目的 探讨亚低温对大鼠局灶性脑梗死后凋亡细胞及谷氨酸转运体(GLT1)和亲代谢型谷氨酸受体(mGluR2/3)表达的影响。方法 88只大鼠随机分为亚低温组、常温组、对照组。制备一侧永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)模型。亚低温组应用贴敷式局部亚低温治疗仪将病灶侧脑部温度降至(33±0.5)℃并持续3 h，常温组保持全身温度在(37±0.5)℃。在脑缺血后3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d用Western印迹法检测各组病灶周围大脑皮质GLT1和mGluR2/3表达；在脑缺血后6 h、24 h、3 d、7 d用末端标记（TUNEL）法检测凋亡细胞。结果 亚低温组在脑缺血后24 h、3 d，常温组在脑缺血后24 h、3 d、7 d脑梗死灶周围凋亡细胞与脑缺血后6 h比较差异有统计学意义(均P<0.01)。在脑缺血后24 h、3 d、7 d，亚低温组凋亡细胞明显少于常温组(均P<0.01)。与对照组相比，亚低温组大鼠脑缺血后3 h、6 h、12 h GLT1表达增加，24 h、3 d、7 d减少；常温组大鼠脑缺血后3 h GLT1表达增加，24 h、3 d、7 d减少(均P<0.05)。在脑缺血后6 h、12 h、7 d，亚低温组GLT1表达显著高于常温组(均P<0.05)。与对照组相比，亚低温组和常温组在脑缺血后3 h、6 h、12 h、24 h、3 d mGluR2/3表达均明显增加(均P<0.05)。在脑缺血后3 h、6 h、24 h、3 d，亚低温组mGluR2/3表达显著高于常温组(均P<0.05)。结论 亚低温能促进脑缺血后星形胶质细胞mGluR2/3和GLT1的表达，减少脑梗死后神经元凋亡。    【关键词】  局部亚低温；永久性大脑中动脉阻塞；谷氨酸转运体；亲代谢型谷氨酸受体    Effects of local mild hypothermia on apoptotic neurons and expression of glutamate transporter and metabotropic glutamate receptor following cerebral ischemia in rats  ZHANG Xin, TANG Ying, WANG Anning, et al. Department of Neurology, First Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China    Abstract：Objective  To investigate the effects of focal mild hypothermia on apoptotic neurons and the expression of glutamate transporter (GLT1) and metabotropic glutamate receptor (mGluR2/3) after cerebral ischemia in rats.Methods  Eightyeight adult rats were randomly divided into mild hypothermia group, normothermia group and control group. Unilateral permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO) was induced. In mild hypothermia group, the brain temperature of occlusive side was decreased and maintained for 3 h at (33±0.5)℃ with Sticking Focal Mild Hypothermia Instrument. The body temperature of normothermia group was maintained at (37±0.5)℃. 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 3 d, 7 d after cerebral ischemia, the expression of GLT1 and mGluR2/3 around infarction cortex were determined by Western Blot. 6 h, 24 h, 3 d, 7 d after cerebral ischemia, TUNEL method was performed to label neuronal apoptosis. Results  24 h, 3 d after cerebral ischemia of mild hypothermia group, 24 h, 3 d, 7 d after cerebral ischemia of normothermia group, the apoptotic neurons around infarction core markedly increased comparing with 6 h after cerebral ischemia(all P<0.01). 24 h, 3 d, 7 d after cerebral ischemia, the apoptotic neurons of mild hypothermia group were less than that of normothermia group(all P<0.01). Comparing with control group, expreession of GLT1 in mild hypothermia group increased at 3 h, 6 h, 12 h, then decreased at 24 h, 3 d, 7 d after cerebral ischemia; expression of GLT1 in normothermia group increased at 3 h, then decreased at 24 h, 3 d, 7 d after cerebral ischemia. 6 h, 12 h, 7 d after cerebral ischemia, expression of GLT1 in mild hypothermia group were much more than that of normothermia group (all P<0.05). 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 3 d after cerebral ischemia, expression of mGluR2/3 in the two groups markedly increased. 3 h, 6 h, 24 h, 3 d, expression of mGluR2/3 in mild hypothermia group were markedly more than that of normothermia group.Conclusion Mild hypothermia may enhance the astrocytic expression of GLT1 and mGluR2/3 and reduce neuron apoptosis following cerebral ischemia.    Key words：focal mild hypothermia;  permanent middle cerebral artery occlusion;  glutamate transporter;  metabotropic glutamate receptor    亚低温(33℃～35℃)对急性脑梗死具有明显的脑保护作用，可以缩小梗死面积、减轻脑水肿、促进神经功能恢复［1］，是目前公认的脑保护治疗措施，但其确切的作用机制还有待于进一步阐明。星形胶质细胞是大脑中数量最多的细胞，以往一直认为星形胶质细胞只在中枢神经系统中起到结构上的支持作用，然而越来越多的研究表明星形胶质细胞在脑生理病理过程中发挥十分重要的作用［2］。急性脑梗死时，细胞外谷氨酸浓度增加，持续作用于谷氨酸受体，引发兴奋性毒性。星形胶质细胞表达的谷氨酸转运体（GLT1）是前脑最主要的谷氨酸清除剂，可以将细胞外多余的谷氨酸转运至胶质细胞内，避免兴奋性损伤［3］。星形胶质细胞表达的代谢性谷氨酸受体3（mGluR3）也在调节兴奋性突触传递中起重要作用［4］。本研究对局部亚低温对大鼠局灶性脑梗死后病灶周围凋亡细胞及GLT1和mGluR2/3表达的影响进行观察，以探讨亚低温的脑保护作用机制。1  材料与方法    1.1  动物与分组  成年健康雄性Wistar大鼠88只，鼠龄2～3个月，质量250～320 g（哈尔滨医科大学第一临床医学院动物实验室提供）。随机分为亚低温组(40只)、常温组(40只)和对照组(8只)。前两组又分为脑缺血后3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d 6个亚组，3 h、12 h亚组4只，其他亚组8只大鼠。    1.2  方法    1.2.1  动物模型制作及处理  10%水合氯醛(0.35 ml/kg)腹腔内注射麻醉大鼠，采用改良的Longa［5］法制备大鼠一侧永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)模型。对照组操作步骤同上，但不插入线栓和结扎颈总动脉。在pMCAO模型制作完成后，亚低温组将局部亚低温治疗仪（哈尔滨工业大学热工教研室研制）的探头与大鼠病灶侧头皮紧密接触，采用SL4型温度传感器（武汉同济医科大学研制），于亚低温使用10 min内测量大鼠病变侧鼓膜温度，使温度降至(33±0.5)℃。同时用加热垫将大鼠病变对侧鼓膜温度和直肠温度保持在(37±0.5)℃，持续3 h后将大鼠置于室温(25℃)自然复温。常温组和对照组大鼠术后置于室温，不进行局部亚低温治疗，术中保持大鼠鼓膜温度及肛温于(37±0.5)℃。    1.2.2  组织学观察及凋亡细胞检测  将亚低温组、常温组脑缺血后6 h、24 h、3 d、7 d亚组和对照组每组4只大鼠经左心室用PBS灌注清洗后，4%多聚甲醛PBS溶液灌注内固定，取脑，4%多聚甲醛PBS溶液外固定。常规石蜡包埋,自视交叉前后取脑组织冠状切片。HE染色显示神经元形态学变化。采用末端标记（TUNEL）法检测凋亡细胞，试剂盒购自ROCHE 公司，操作按说明书进行。每张切片于大脑皮质梗死灶周边半暗带选择10个高倍视野，计数TUNEL阳性细胞总数。    1.2.3  GLT1、mGluR2/3检测  将亚低温组、常温组脑缺血后各时间点亚组和对照组每组4只大鼠麻醉，断头处死，取病灶周围大脑皮质新鲜组织-80℃保存，剩余脑组织用1% TTC (2,3,5triphenyltetrazolium chloride)染色。将冰冻脑组织匀浆离心(11000 g) 10 min，取上清。再次高速离心(100000 g) 60 min后弃上清，细胞裂解液将沉淀溶解，所得即为膜蛋白。样品用Bradford法测定蛋白含量，每个泳道取70 μg 蛋白样经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转印蛋白至PVDF(polyvinylidene difluoride)膜(Pierce公司)，脱脂奶粉4℃封闭过夜。兔抗GLT1(1:200)(Santa Cruz公司)或兔抗mGluR2/3(1:1000)(Upstate公司)与鼠抗β微管蛋白(βTubulin) (1:1000)(华特生公司)室温孵育2 h，PBST清洗；Alexa fluor 800 nm羊抗兔和700 nm羊抗鼠的二抗(1:4000) (invitrogen公司)孵育1 h，PBST清洗。Odyssey红外荧光扫描成像系统对膜上蛋白质进行检测，应用Odyssey v1.2软件分析结果。    1.2.4  统计学方法  检测结果以均数±标准差(±s)表示，差异显著性检验采用t检验，全部数据统计由SPSS 13.0 软件包完成。2  结  果    2.1  脑组织学改变  HE染色显示亚低温组和常温组脑缺血后24 h大鼠脑梗死灶在大脑中动脉阻塞侧，分布于额、顶、颞叶及同侧丘脑、基底节；梗死灶灰质暗淡、组织结构紊乱、细胞坏死溶解。梗死灶周围神经元胞体皱缩、胞核固缩、胞浆嗜酸性变；对照组大鼠脑组织结构正常，神经元形态正常。    2.2  亚低温组与常温组凋亡细胞比较  见表1、图1。 对照组未见凋亡细胞。在脑缺血后6 h，亚低温组表1  亚低温组与常温组脑缺血后不同时间TUNEL阳性细胞数比较注：与常温组比较△P<0.01；与脑缺血后6 h比较*P<0.01    和常温组大鼠脑梗死灶周围均出现少量凋亡细胞；在脑缺血后24 h、3 d，亚低温组和常温组大鼠脑梗死灶周围出现大量凋亡细胞，与脑缺血后6 h比较差异有统计学意义(均P<0.01)，亚低温组又明显少于常温组(均P<0.01)；在脑缺血后7 d，亚低温组和常温组大鼠脑梗死灶周围凋亡细胞较脑缺血后24 h、3 d有    图1  A、B：常温组大鼠脑缺血后24 h、3 d梗死灶周围出现大量凋亡细胞；C、D：亚低温组大鼠脑缺血后24 h、3 d梗死灶周围的凋亡细胞明显少于常温组（TUNEL ×100）    减少，常温组凋亡细胞仍显著高于脑缺血后6 h(均P<0.01)，而亚低温组明显少于常温组(P<0.01)。    2.3  亚低温组与常温组大脑皮质GLT1含量比较  见表2。两组均有GLT1表达，与对照组（0.291±0.013）相比，亚低温组及常温组在脑缺血后3～12 h，GLT1表达明显上升，在脑缺血后24 h～7 d明显下降，亚低温组在7 d时GLT1表达有所回升（均P<0.05）。与常温组比较，在脑缺血后6 h、12 h、7 d，亚低温组GLT1表达显著高于常温组(均P<0.05)。    2.4  亚低温组与常温组大脑皮质mGluR2/3含量比较  见表3。两组均有mGluR2/3表达，与对照组（12.88±1.21）相比，在脑缺血后3 h～3 d，亚低温组和常温组mGluR2/3表达均明显升高（均P<0.05）；而亚低温组脑缺血3 h、6 h、24 h和3 d mGluR2/3表达又显著高于常温组(均P<0.05)。表2   亚低温组与常温组脑缺血后不同时间GLT1表达比较表3  亚低温组与常温组脑缺血后不同时间mGluR2/3表达比较3  讨  论    由于临床病例中绝大多数脑梗死患者属于血管不可再通的局部脑梗死，本研究用大鼠pMCAO模型以更好地模拟人脑梗死的病理过程。谷氨酸是人脑最主要的兴奋性氨基酸，脑缺血时细胞外谷氨酸浓度增加，持续作用于兴奋性氨基酸受体，引发神经元兴奋性损伤［6］。细胞外谷氨酸由细胞膜上的兴奋性氨基酸转运体(EAATs)清除。目前已发现5种 EAATs 亚型： GLAST (human EAAT1)，GLT1 (human EAAT2)，EAAC1(human EAAT3)，EAAT4 和 EAAT5。其中，GLT1在星形胶质细胞上表达，是前脑细胞外谷氨酸最主要的清除剂［3］。Rao等［7］发现利用反义核苷酸抑制GLT1会加重缺血神经元损伤，提示脑缺血时GLT1对谷氨酸吸收亦起到重要作用。影响GLT1表达的原因还不十分清楚，普遍认为神经元及其分泌的因子可促进GLT1表达［4］。缺血性脑损伤的病理过程与细胞凋亡有关［8］，本研究发现在脑梗死后6 h，常温组和亚低温组梗死灶周围凋亡细胞很少，在脑梗死后24 h、3 d，两组均出现大量凋亡细胞，而在脑梗死后24 h、3 d 两组GLT1表达均显著下降，可能是由于梗死灶周围神经元凋亡达到高峰［9］，神经元与胶质细胞相互作用减弱造成。脑梗死后24 h～7 d，亚低温组凋亡细胞明显少于常温组，与以往的研究［8］类似。在脑梗死后7 d亚低温组GLT1表达显著高于常温组，一个原因可能是亚低温组神经元损伤较轻，神经元与胶质细胞相互作用恢复较快；另一个原因可能是亚低温能够减轻缺血引起的蛋白质合成抑制［10］。    与以往发现的亲离子型谷氨酸受体(iGluRs)不同，mGluRs与G蛋白偶联，通过第二信使发挥作用。mGluRs有mGluR1～mGluR8 8个亚型，分为3组：Ⅰ组：mGluR1和mGluR5；Ⅱ组：mGluR2和mGluR3；Ⅲ组：mGluR4，mGluR6，mGluR7和mGluR8。其中Ⅱ组mGluR(mGluR2/3)与腺苷酸环化酶系统被动偶联，激活mGluR2/3可抑制兴奋性传递，对神经元起到保护作用。Kingston等［11］研究认为，激活Ⅱ组mGluR可以阻止脑缺血神经元变性，减少梗死面积。本研究的结果显示，脑梗死后3 h～3 d常温组及亚低温组mGluR2/3表达均增加，亚低温组增加更明显。相应地，脑梗死后24 h～7 d，亚低温组凋亡细胞明显少于常温组，提示mGluR2/3具有脑保护作用。虽然使用的抗体无法区分mGluR2和mGluR3，而mGluR2表达于神经元，mGluR3在星形胶质细胞上高表达，在神经元上亦有表达，但在脑组织损伤处及其周围，只有激活的星形胶质细胞表达mGluR3增加［12］，本实验中mGluR2/3可能主要反映了梗死灶周围星形胶质细胞mGluR3的表达，间接反映了星形胶质细胞的活化。影响mGluR3表达的机制不十分清楚。Ferraguti等［12］提出，中枢神经系统损伤时，成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子α（TGFα）等生长因子分泌增加，使mGluR3等被激活且表达增加，可能是神经组织自我保护、修复的机制。而亚低温能够促进mGluR3表达，提示亚低温可能通过此途径完成神经保护作用。    常温组在脑梗死后3 h、 亚低温组在脑梗死后3～12 h，GLT1表达较对照组升高，这显然与神经元的作用无关。Kim等［13］对沙鼠全脑短暂性脑缺血后海马GLT1表达进行观察，结果与本实验相似，GLT1表达先升高后降低，认为GLT1表达升高可能与星形胶质细胞逆转运谷氨酸有关。然而相关动物研究［7,14］已证明脑缺血时主要是神经元表达的转运体发生逆转运，星形胶质细胞表达的GLT1并不参与此过程。Aronica等［15］研究发现，激活Ⅱ组mGluR可以增加GLAST、GLT1的表达。Yao等［16］亦提出，mGluR2/3被激活后细胞外谷氨酸的吸收增加。因此，推测GLT1表达增加与脑梗死后mGluR3增加有关。亚低温组在梗死后早期mGluR3和GLT1表达均增加并显著高于常温组，也提示mGluR3和GLT1的密切联系。故亚低温影响脑梗死后GLT1表达的可能机制是：脑梗死后梗死灶周围星形胶质细胞活化，mGluR3表达增加，可以促进GLT1表达。然而随着缺血时间延长、能量耗竭、神经元损伤加重，GLT1相应减少，转运谷氨酸的能力降低，细胞外谷氨酸进一步升高，产生恶性循环。亚低温可促进mGluR3表达，从而促进GLT1表达，延长其表达增加的时间，增加谷氨酸转运，减轻神经元兴奋性损伤，使GLT1表达尽早恢复，减轻恶性循环。    本研究采用的低温仪应用半导体循环水原理，由电脑精确控制温度，作用在病灶局部，可在20 min内使病变中心温度降至32～33℃［17］；在实验过程中亦监测双侧鼓膜温度及肛温，证实低温仪能够在10 min内将病灶侧鼓膜温度降至亚低温水平并保持稳定，不影响病灶对侧及全身温度。【参考文献】  ［1］王德生, 张守信. 亚低温脑保护 ［M］. 第1版. 北京: 科学出版社, 2002. 19～36.  ［2］Markiewicz I, Lukomska B. The role of astrocytes in the physiology and pathology of the central nervous system ［J］. Acta Neurobiol Exp (Wars), 2006, 66: 343.  ［3］Danbolt Niels C. Glutamate uptake ［J］. Progress Neurobiology, 2001, 65: 1.  ［4］Winder DG, Conn PJ. Roles of metabotropic glutamate receptors in glial function and glialneuronal communication ［J］. J Neurosci Res, 1996, 46: 131.  ［5］Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats ［J］. Stroke, 1989, 20: 84.  ［6］于岚, 武祺,关颖, 等.急性脑梗死患者脑脊液兴奋性氨基酸水平的变化及其临床意义［Ｊ］.临床神经病学杂志,2005,18:373.  ［7］Rao VLR, Dogan A, Todd KG, et al. Antisense knockdown of the glial glutamate transporter GLT1, but not of the neuronal glutamatetransporter EAAC1, exacerbates transient focal cerebral ischemiainduced neuronal damage in rat brain ［J］. J Neurosci, 2001, 21: 1876.  ［8］储照虎, 朱武生, 吴家幂, 等. 亚低温对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及Bcl2、Bax 的影响 ［J］. 临床神经病学杂志, 2001, 14: 330.  ［9］戚基萍, 王德生, 王立峰, 等. 人脑局灶性缺血后海马神经元损伤与半胱氨酸蛋白酶3的关系 ［J］. 中华神经科杂志, 2005, 38: 112.  ［10］Kataoka K, Yanase H. Mild hypothermia——a revived countermeasure against ischemic neuronal damages ［J］. Neurosci Res, 1998, 32: 103.  ［11］Kingston AE, ONeill MJ, Lam A, et al. Neuroprotection by metabotropic glutamate receptor glutamate receptor agonists: LY354740, LY379268 and LY389795 ［J］. Eur J Pharmacol, 1999, 377: 155.  ［12］Ferraguti F, Corti C, Valerio E, et al. Activated astrocytes in areas of kainateinduced neuronal injury upregulate the expression of the metabotropic glutamate receptors 2/3 and 5 ［J］. Exp Brain Res, 2001, 137: 1.  ［13］Kim DS, Kwak SE, Kim JE, et al. Transient ischaemia affects plasma membrane glutamate transporter, not vesicular glutamate transporter,expressions in the gerbil hippocampus［J］. Anat Histol Embryol, 2006, 35: 265.  ［14］Yeh TH, Hwang HM, Chen JJ, et al. Glutamate transporter function of rat hippocampal astrocytes is impaired following the global ischemia ［J］. Neurobiol Dis, 2005, 18: 476.  ［15］Aronica E, Gorter GA, IjlstKeizers H, et al. Expression and functional role of mGluR3 and mGluR5 in human astrocytes and glioma cells: opposite regulation of glutamate transporter proteins ［J］. Eur J Neurosci, 2003, 17: 2106.  ［16］Yao HH, Ding JH, Zhou F, et al. Enhancement of glutamate uptake mediates the neuroprotection exertedby activating group II or III metabotropic glutamate receptors on astrocytes ［J］. J Neurochem, 2005, 92: 948.  ［17］王德生, 刘巍松, 丰宏林, 等. 局部亚低温对猪脑部温度梯度的影响 ［J］. 中华医学杂志, 2001, 81: 849.