鼻咽癌患者机体TCR Vβ亚家族取用格局与预后相关性研究

　　张月琴　陈静　曲玲　宋美燕　邱玉芹 作者单位：264000　山东省，烟台市烟台山医院耳鼻喉科

　　【摘要】 目的　研究鼻咽癌(NPC)患者机体TCR Vβ 24个亚家族的表达格局情况，探讨其与肿瘤分期及预后的关系。方法　采用流式细胞仪技术，检测44例NPC各期放疗前患者机体TCR Vβ 24个亚家族的表达情况，并与18例正常对照组人群进行对比，分析TCR Vβ 24个亚家族各指标的表达情况与肿瘤分期及预后的关系。结果　(1)NPC组同正常对照组相比，TCR Vβ1、Vβ7.1、Vβ7.2、Vβ9、Vβ13.1等表达明显升高(P<0.05)，而TCR Vβ5.2、 Vβ5.3和Vβ23表达则显著降低(P<0.05);(2)TCR Vβ 24个亚家族中TCR Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ9、Vβ11、Vβ13.1、Vβ13.2及Vβ18等差异性表达(P<0.05)与NPC肿瘤TNM分期及临床分期有密切关系;(3)5年生存患者与5年死亡患者相比体内TCR Vβ5.2、Vβ13.2 及Vβ18的表达差异具有统计学意义(P<0.05)，而5年无瘤生存患者与5年复发转移及死亡患者相比，体内TCR Vβ5.2、Vβ9、 Vβ11、Vβ13.2 及Vβ18表达差异具有统计学意义(P<0.05)。结论　TCR Vβ 24个亚家族取用格局差异与NPC的TNM分期及肿瘤临床分期存在相关性，并可能作为NPC肿瘤患者判断预后的前瞻性指标。

　　【关键词】 鼻咽肿瘤;　受体，抗原，T细胞;　预后

　　【Abstract】　Objective　To analyze the expression of TCR Vβ in different clinical stages of NPC;and the relation with prognosis.Methods　Forty-four specimens of pathologically confirmed different clinical stages NPC were tested,18 normal tissue as comparison group.The expression of TCR Vβ were examined by flow cytometry (FCM)，and then analyzed the relationships between two factors with the patients′ prognosis and with patients′ clinical pathologic features.Results　The expressions of TCR Vβ1，Vβ7.1，Vβ7.2，Vβ9，Vβ13.1 in NPC were higher than the normal tissue (P<0.05)，but TCR Vβ5.2， Vβ5.3 and Vβ23 were lower than the normal tissue;The expression of TCR Vβ5.2，Vβ5.3，Vβ9，Vβ11，Vβ13.1，Vβ13.2 and Vβ18 were correlated with the TNM stages of NPC(P<0.05);The differences of TCR Vβ5.2，Vβ13.2 and Vβ18 expression between 5-year survival group and 5-year death group were great significant (P<0.05).And the differences of TCR Vβ5.2，Vβ9， Vβ11，Vβ13.2 and Vβ18 expression between 5-year survival without tumor group and non-5-year survival without tumor group were great significant (P<0.05).Conclusions　The expressions of TCR Vβ family in NPC have relationship with the TNM stages and clinical stages，can be used as prognostic molecular markers in NPC patients.

　　【Key words】　Nasopharyngeal neoplasms;　Receptors，antigen，T-cell;　Prognosis

　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一类起源于鼻咽上皮，具有颈淋巴结转移早、远处转移发生率高等特点的头颈部恶性肿瘤。目前研究认为，在控制免疫原性肿瘤生长过程中，细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介导的细胞免疫应答起到了重要的作用。而T细胞在免疫监视的过程中，则通过具有高度多样性的T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别肿瘤抗原，进而参与到干预肿瘤疾病的发生和发展过程中。机体TCR在判断肿瘤患者病情，预测预后方面可能具有潜在的价值。本研究应用流式细胞术，观察了44例NPC患者外周血TCR Vβ 24个亚家族取用格局与患者病情预后之间的关系。

　　资料与方法

　　1. 一般资料：烟台山医院2001年11月至2008年11月通过鼻咽镜活检病理诊断为NPC的患者44例，男29例，女15例，患者年龄16～68岁，中位年龄51岁。病理类型均为低分化鳞癌，全部病例血清学检查EBV阳性，其临床资料完整。根据临床检查、影像学检查与病理检查判断局部淋巴结与远处转移。按照2002年国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC)分期标准进行分期：T1 6例，T2 9例，T3 17例，T4 12例;N0 9例，N1 14例，N2 18例，N3 3例。临床分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期14例，Ⅲ期16例，Ⅳ期10例。健康志愿者18例，作为正常对照组。正常对照组与鼻咽癌患者在年龄、性别、比例等方面具有可比性(P>0.05)。所有纳入研究中的病例，诊断后均经根治性放疗，治疗方案基本一致。6MV-X线常规分割，鼻咽照射剂量为每6～8周60～80 Gy，阳性颈淋巴结为每6～7周64～70 Gy。随访期36～74个月，中位随访63个月，末次随访时间2009年12月，随访内容包括体检、鼻内镜检查、鼻咽CT或MRI、胸部X线片、肝脏超声、血生化检查。

　　2. TCR Vβ 24个亚家族的表达检测：在纳入研究后放射治疗前一天清晨空腹，取研究对象全血2 ml，用EDTA-K2抗凝管抗凝。检测时在流式细胞术检测专用管中，分别加入各种荧光素标记的单克隆抗体：抗CD3 mAb(PC5)、抗TCR Vβ1 mAb (PE+FITC)、抗TCR Vβ2 mAb (PE+FITC)、抗TCR Vβ3 mAb (FITC)、抗TCR Vβ4 mAb (PE+FITC)、抗TCR Vβ5.1 mAb (PE+FITC)、抗TCR Vβ5.2 mAb (PE)、抗TCR Vβ5.3 mAb (PE)、抗TCR Vβ7.1 mAb (PE+FITC)、抗TCR Vβ7.2 mAb (FITC)、抗TCR Vβ8 mAb (FITC)、抗TCR Vβ9 mAb (PE)、抗TCR Vβ11 mAb (PE)、抗TCR Vβ12 mAb (FITC)、抗TCR Vβ13.1 mAb (PE)、抗TCR Vβ13.2 mAb (PE)、抗TCR Vβ13.6 mAb (PE+FITC)、抗TCR Vβ14 mAb (FITC)、抗TCR Vβ16 mAb (FITC)、抗TCR Vβ17 mAb (PE+FITC)、抗TCR Vβ18 mAb (PE)、抗TCR Vβ20 mAb (FITC)、抗TCR Vβ21.3 mAb (FITC)、抗TCR Vβ22 mAb (PE+FITC)和抗TCR Vβ23 mAb (PE)各10 μl，然后加入抗凝血50 μl。混匀后，于室温避光孵育15 min，再加入溶血素溶血、离心洗涤2次。最后将沉淀溶于PBS中，用Coulter ESP流式细胞仪进行检测。流式细胞仪以及溶血素和荧光素标记单克隆抗体均为美国贝克曼库尔特公司产品。

　　3. 统计学分析：使用SPSS 13.0软件建立数据库，并进行分析。两样本均数比较采用t检验;多样本均数比较采用单因素方差分析(One way-ANOVA)，组间两两比较采用LSD法。

　　结　　果

　　一、NPC组与正常组之间TCR Vβ 24个亚家族表达的差异

　　NPC组同正常对照组相比，TCR Vβ 24个亚家族检测结果中TCR Vβ1、Vβ7.1、Vβ7.2、Vβ9、Vβ13.1等表达明显升高(P<0.05)，而TCR Vβ5.2、 Vβ5.3和Vβ23表达则显著降低(P<0.05)(表1)，即出现TCR Vβ 24个亚家族T细胞分布不均和特异性克隆增殖。

　　二、TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC患者临床资料间的关系

　　1. TCR Vβ 24个亚家族表达与性别、年龄的关系：TCR Vβ 24个亚家族的表达格局，在NPC男女患者体内整体上差异无统计学意义(P>0.05)。但是男性患者体内TCR Vβ21和Vβ23的表达明显低于女性患者，差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。表1　NPC患者与正常对照组TCR Vβ表达的比较表2　NPC患者TCR Vβ表达与性别的关系

　　2. TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC肿瘤T分期的关系：T1～T2组同T3～T4组相比，患者体内TCR Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ9、Vβ11及Vβ18的表达差异具有统计学意义(P<0.05)(表3)。

　　3. TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC肿瘤N分期的关系：N0～N1组与N2～N3组相比，患者体内TCR Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ9 及Vβ18等表达差异具有统计学意义(P<0.05)(表4)。

　　4. TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC肿瘤临床分期的关系：Ⅰ～Ⅱ组与Ⅲ～Ⅳ组相比，患者体内TCR Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ13.1、Vβ13.2及Vβ18等表达差异均具有统计学意义(P<0.05)(表5)。

　　5. TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC患者生存的关系：研究中的44例NPC患者均进行放疗，并在治疗后进行随访，其随访期36～74个月，中位随访63个月，末次随访时间2009年12月。随访中共发现：有6例患者死亡，6例患者复发，15例患者远处转移，其中骨转移8例、肺转移3例、肝转移1例、其他部位转移3例。

　　经检测患者TCR Vβ 24个亚家族表达格局，并对比分析发现：5年生存者与5年死亡者机体内TCR Vβ5.2、Vβ13.2 及Vβ18的表达差异具有统计学意义(P<0.05)(表6)。

　　而5年无瘤生存组与5年复发转移及死亡组相比，患者体内TCR Vβ5.2、Vβ9、 Vβ11、Vβ13.2 及Vβ18表达差异具有统计学意义(P<0.05)(表7)。表3　NPC患者TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC肿瘤T分期的关系表4　TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC肿瘤N分期的关系表5　TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC肿瘤临床分期的关系表6　TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC患者生存的关系表7　TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC患者预后的关系

　　讨　　论

　　NPC是临床上常见的头颈部恶性肿瘤之一，其发生发展是多因素共同参与作用的结果。如同大多数肿瘤一样，NPC疾病过程中，往往因肿瘤抗原的免疫原性弱、抗原调变，肿瘤抗原的加工、提呈障碍等因素，不能诱发机体有效的抗肿瘤免疫应答，加之诊断的滞后和治疗干预方法等限制，导致目前NPC临床五年生存率仍然徘徊在50%左右。死亡患者中远处转移率可高达65%～70%[1]。机体个体免疫监视因素低下，而由此带来的肿瘤远处转移和复发是NPC治疗失败的主要原因。

　　目前研究发现树突状细胞(DC)及肿瘤细胞本身均能有效激活机体免疫细胞，特别是CTL细胞介导的细胞免疫是机体抗肿瘤的重要屏障，它可有效识别并杀伤肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞的凋亡，从而对防止肿瘤的发生及脱离原发灶进入血液循环转移，起着关键的免疫监视作用[2]。正是鉴于CTL在抗NPC等恶性肿瘤疾病中的价值，其已经逐渐应用于临床[3-6]，并取得了良好的效果。

　　而在T淋巴细胞在识别肿瘤细胞成分的过程中，TCR起到了决定性的作用。TCR Vβ亚家族的分布与克隆性基因谱的分析，是近年国内外学者用于评估体内T细胞介导的免疫应答特点的分子生物学方法。在NPC患者机体内，可能会由于特异性的肿瘤抗原刺激的出现，导致个体T细胞TCR Vβ发生特异性重排，进而导致TCR Vβ 24个亚家族T细胞分布不均性克隆[6]。这些都是特异性CTL抗肿瘤免疫作用的表现，并可能与患者预后密切相关。

　　本研究的24个TCR Vβ片段包括了正常人70%CD3阳性淋巴细胞TCR Vβ谱系[7]，通过检测机体TCR Vβ 24个亚家族的表达格局情况，可探讨其与NPC病情轻重及预后的相关性。

　　研究中发现NPC组同正常对照组相比，TCR Vβ 24个亚家族检测结果中TCR Vβ1、Vβ7.1、Vβ7.2、Vβ9、Vβ13.1等表达明显升高，而TCR Vβ5.2、 Vβ5.3和Vβ23表达则显著降低，即提示出现TCR Vβ 24个亚家族T细胞分布不均和特异性克隆增殖。而对比分析TCR Vβ 24个亚家族表达格局与NPC患者临床资料间的相关性时，发现NPC男性患者体内TCR Vβ21和Vβ23的表达明显低于女性患者。这表明不同性别NPC患者体内，T淋巴细胞在识别肿瘤抗原能力上有差异，这可能与NPC发病的男女比例失调有关，但需要进一步深入研究。此外，我们对比了TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC肿瘤T、N分期及临床分期之间的关系，找到了TCR Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ9、Vβ11、 Vβ13.1、Vβ13.2及Vβ18等几个潜在的能够提示病情轻重的重要观测点。进一步的TCR Vβ 24个亚家族表达与NPC患者生存预后相关研究的结果提示，TCR Vβ5.2、Vβ9、Vβ11、Vβ13.2 及Vβ18等将可能成为推断NPC患者预后结局的指标。

　　本试验结果表明，TCR Vβ 24个亚家族表达格局差异对于预测肿瘤患者病情的轻重以及预后可能具有关键性价值。同时也将有助于揭示NPC免疫逃逸的分子基础，进而指导临床采取积极的治疗和控制措施，达到提高NPC生存率、延长生存期的目的。但这些都还需要进一步更加系统的动物模型实验及临床免疫学观察来研究。

　　【参考文献】

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　　[2]　姚新生，马骊，温茜，等.监测TCR CDR3漂移的免疫扫描谱型分析技术的建立与鉴定.中华微生物学和免疫学杂志，2006,26(6)：571-573.

　　[3]　Lucas KG，Salzman D，Garcia A，et al.Adoptive immunotherapy with allogeneic Epstein-Barr virus (EBV)-specific cytotoxic T-lymphocytes for recurrent，EBV-positive Hodgkin disease.Cancer,2004,100(9)：1892-1901.

　　[4]　杜海军，周玲，左建民，等.EBV-LMP2多肽激活的特异性CTL抑制同HLA-Ⅰ亚型的鼻咽癌移植瘤的形成.中国肿瘤生物治疗杂志，2004,11(3)：157-160.

　　[5]　常红，罗薇，马骊，等.IL-2体外诱导健康人外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移的研究.南方医科大学学报，2007,27(4)：433-435.

　　[6]　常红，罗薇，马骊，等.鼻咽癌细胞株体外诱导同种异体T细胞TCR VβCDR3谱型和细胞毒性分析.广东医学，2007,28(6)：878-880.

　　[7]　Wei S，Charmley P，Robinson MA，et al.The extent of the human germline T-cell receptor V beta gene segment repertoire.Immunogenetics,1994,40(1)：27-36.