辛芷鼻敏胶囊对大鼠变应性鼻炎上下呼吸道CCR3表达的影响

　　司红莉 , 王宏伟2, 高丽2 作者单位：(1武警新疆总队南疆指挥部医院内科， 新疆喀什844000; 2新疆医科大学, 新疆乌鲁木齐830011)

　　【摘要】 目的通过观察辛芷鼻敏胶囊对变应性鼻炎模型大鼠鼻黏膜和肺组织中嗜酸细胞趋化因子受体3(CCChemokine receptor3，CCR3)mRNA表达的影响,探讨辛芷鼻敏胶囊对变应性鼻炎模型大鼠上下呼吸道的作用机制。为辛芷鼻敏胶囊应用于临床提供实验依据。方法以卵清蛋白致敏法建立变应性鼻炎大鼠模型，40 只健康大鼠随机分为空白组、实验组(辛芷鼻敏胶囊)、对照组(鼻炎康)和模型组 (n=10)，原位杂交法检测鼻黏膜和肺组织中CCR3mRNA表达。结果大鼠鼻黏膜及肺组织CCR3 mRNA在模型组呈阳性表达，在空白组呈弱阳性表达，模型组表达明显高于空白组(P<0.01);模型组鼻黏膜和肺组织CCR3mRNA的表达明显高于实验组和对照组(P<0.01);实验组鼻黏膜和肺组织CCR3mRNA的表达低于 对照组(P<0.05)。结论辛芷鼻敏胶囊可下调变应性鼻炎大鼠模型鼻黏膜和肺组织CCR3mRNA的表达，提示其可能是通过影响CCR3mRNA的表达来治疗变应性鼻炎。

　　【关键词】 变应性鼻炎; 上下呼吸道; 嗜酸细胞趋化因子受体3; 原位杂交

　　Abstract: ObjectiveTo investigate the effect of Xinzhi Bimin capsule on the expressions of CCR3mRNA in the upper and lower respiratory of experimental allergic rhinitis in Sprague Dawley rats. MethodsAllergic rhinitis models were established by the ovalbumin challenge method. Fourty healthy SD rats were randomly divided into four groups: normal group, allergic rhinitis models group, Biyankang capsule group and Xinzhi Bimin capsule group (n=10). Expressions of CCR3mRNA in the upper and lower respiratory of the four groups were detected in situ Hybridization. ResultsThe positive expressions of CCR3mRNA in the nasal mucosa and the lung tissue of allergic rhinitis models group were significantly higher than those of normal group (P<0.01), indicating that CCR3mRNA are related to the pathogenesis of allergic rhinitis. The expressions of Normal SD rats is soft . The expressions of CCR3 mRNA of allergic rhinitis models group is obviously higher than Biyankang capsule group and Xinzhi Bimin capsule group (P<0.01). The expressions of CCR3 mRNA in the nasal mucosa and the lung tissue of Biyankang capsule group were higher than those of Xinzhi Bimin capsule group (P<0.05). ConclusionThe result suggests that the capsule of Xinzhi Bimin may treat the symptom of AR in rat by down regulating the activation of CCR3mRNA.

　　Key words:　allergic rhinitis; the upper and lower respiratory; CCR3; in situ Hybridization

　　变应性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)是特应性个体接触致敏原后由IgE介导的介质释放、并有多种免疫活性细胞和细胞因子等参与的鼻黏膜慢性炎症反应性疾病。病理的特征性改变为嗜酸粒细胞(Eosinophil)的浸润和活化[1]。嗜酸性粒细胞趋化因子受体3 (CCChemokinereceptor3， CCR3)主要参与嗜酸性粒细胞迁移、颗粒释放以及细胞快速形态变化等一系列生物学效应[2]。本实验是在前期研究的基础上，研究辛芷鼻敏胶囊对CCR3 mRNA的表达的影响，为其治疗AR 提供理论依据。

　　1材料和方法

　　1.1材料健康SD大鼠40只，体重200～220 g，雌雄各半，由新疆医科大学动物实验中心提供。辛芷鼻敏胶囊由新疆医科大学中医学院实验中心提供。鼻炎康片由佛山德众药业有限公司提供(国药准字Z20023063，生产批号：04109)。卵清蛋白V级(OVA，Sigma公司，美国)。CCR3原位杂交试剂盒由西安沃尔森生物工程有限公司提供。麦克奥迪数码医学图像分析系统，由新疆维吾尔自治区地方病暨分子生物学实验室提供。

　　1.2造模造模采用卵清蛋白致敏法，健康SD大鼠40只随机分为4组：空白组、模型组、实验组(辛芷鼻敏胶囊)、对照组(鼻炎康片)，每组10只，雌雄各半，分笼饲养。空白组用氢氧化铝凝胶3 g加生理盐水100 ml制成混悬液作抗原，模型组、实验组、对照组用1%卵清蛋白100 ml加氢氧化铝凝胶3 g作抗原，每鼠腹腔注射2 ml，隔日一次，共7次，为基础致敏。再用2%卵清蛋白生理盐水攻击双侧鼻腔，每侧50 μl，每日一次，共10次，为强化攻击。空白组用等量的生理盐水代替卵清蛋白及氢氧化铝腹腔注射和滴鼻攻击，方法同上。鼻分泌物涂片见大量嗜酸性粒细胞为造模成功。造模成功后进行灌胃，实验组给予辛芷鼻敏胶囊，灌胃剂量2.3 g·kg-1·d-1，对照组予鼻炎康1.8 g·kg-1·d-1灌胃。将药物充分研磨后用蒸馏水配成混悬液，使每鼠每日灌药量均为2 ml，空白组、模型组灌服2 ml生理盐水。连续给药7 d。

　　1.3制做病理切片第7天灌药后2 h，以戊巴比妥钠溶液 (40 mg/kg)腹腔注射，麻醉后迅速取出鼻中隔双侧鼻腔呼吸区黏膜。在0.9%生理盐水中洗去血液和黏液，鼻黏膜放入4%多聚甲醛中固定12 h后放入75%酒精中保存待用。切取右下叶部分肺组织, 4%多聚甲醛固定24 h后放入75%酒精中保存待用。经逐级酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、,制成切片厚4 μm，保存备用。

　　1.4鼻粘膜和肺组织中CCR3mRNA的检测采用原位杂交法检测鼻粘膜和肺组织中CCR3mRNA的表达。(1)烤片30 min、脱蜡、水化;(2)预处理(微波抗原修复)：0.01 mmol/L枸橼酸抗原修复液，解冻温度(92～98℃)13 min ×1 次，室温冷却，蒸馏水洗涤 3 min ×1 次，原位杂交专用PBS溶液室温洗涤 3 min×2 次;(3)封闭内源性过氧化物酶：3% H2O2，室温放置10 min，蒸馏水洗涤 3 min×1 次，原位杂交专用PBS溶液洗涤 3 min×3 次，0.2×SSC室温洗涤 3 min×1 次;(4)滴加预杂交工作液覆盖组织，盖原位杂交专用盖玻片，37℃恒温箱，湿盒孵育1 h;(5)预杂交后洗涤：揭去盖玻片，0.2×SSC室温洗涤5 min ×3 次;(6)滴加杂交工作液覆盖组织，盖原位杂交专用盖玻片，37℃恒温箱，湿盒孵育3 h;(7)杂交后洗涤：揭去盖玻片， 2×SSC 37℃洗涤5 min ×3 次，0.2×SSC 37℃洗涤5 min ×3，原位杂交专用PBS溶液37℃洗涤5 min ×3 次;(8)滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液覆盖组织，37℃恒温箱，湿盒孵育 45 min，原位杂交专用PBS溶液室温洗涤 5 min ×3 次;(9)滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液覆盖组织，37℃恒温箱，湿盒孵育 45 min，原位杂交专用PBS溶液室温洗涤 5 min ×3 次;(10)DAB显色10 min，蒸馏水终止反应，苏木素复染10 min，胞核为蓝色，蒸馏水洗后盐酸乙醇分化，0.01 mmol/L PBS缓冲液室温返蓝10 min，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片常温保存。

　　1.5结果判定标准CCR3mRNA阳性产物定位于细胞质，以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性。使用麦克奥迪数码医学图像分析系统，以平均吸光度代表阳性表达率。平均吸光度=(阳性目标平均灰度阴性目标平均灰度)÷光密度定标值。

　　1.6统计学处理应用SPSS13.0统计软件，所有数据均进行正态性检验，以均数±标准差(±s)表示。多组计量资料采用单因素方差分析，检验水准α= 0.05 。

　　2结果

　　2.14组大鼠鼻黏膜CCR3mRNA原位杂交结果空白组大鼠鼻黏膜上皮细胞中CCR3mRNA呈表达弱阳性，为淡棕黄色颗粒(图1)。其余各组见不同程度的阳性表达，模型组见强阳性表达于鼻黏膜上皮细胞及腺上皮细胞，为棕褐色颗粒(图2);实验组鼻黏膜上皮细胞及腺上皮细胞表达弱阳性，为淡棕黄色颗粒(图3);对照组鼻黏膜上皮细胞及腺上皮细胞表达弱阳性，为棕黄色颗粒(图4)。

　　2.24组大鼠鼻黏膜CCR3mRNA结果比较与空白组比较，模型组、对照组、实验组CCR3 mRNA表达均高于空白组(P<0.01)。与模型组比较，对照组、实验组CCR3 mRNA表达均低于模型组(P<0.01)。与对照组比较，实验组CCR3 mRNA表达量低于对照组(P<0.01),具体结果见表1。

　　表14组大鼠鼻黏膜CCR3mRNA结果比较处理组例数±sF 值空白组10 0.080±0.03228.467模型组10 0.182±0.029*实验组10 0.126±0.019*●对照组100.153±0.020*●▲注：与空白组比较， * P<0.01; 与模型组比较， ● P<0.01; 与对照组比较， ▲ P<0.012.34组大鼠肺组织CCR3mRNA原位杂交结果空白组肺上皮细胞中CCR3mRNA呈弱阳性，散在表达，为淡棕黄色颗粒(图5)。其余各组见不同程度的阳性表达，模型组见阳性表达于肺上皮细胞、巨噬细胞和其他炎性细胞细胞，为棕褐色颗粒(图6);实验组肺支气管内皮细胞表达呈弱阳性，为淡棕黄色颗粒(图7);对照组肺支气管周围巨噬细胞中CCR3mRNA表达呈弱阳性，为棕黄色颗粒(图8)。

　　淡棕黄色颗粒微弱表达于肺支气管周围巨噬细胞2.44组大鼠肺组织CCR3mRNA结果比较与空白组比较，模型组、对照组、实验组CCR3 mRNA表达均高于空白组(P<0.01)。与模型组比较，对照组、实验组CCR3 mRNA表达均低于模型组(P<0.01)。与对照组比较，实验组CCR3 mRNA表达量低于对照组(P<0.01),结果见表2。

　　表14组大鼠鼻黏膜CCR3mRNA结果比较处理组例数±sF 值P 值空白组10 0.099±0.03263.2050.000模型组10 0.210±0.014*实验组10 0.160±0.009*●对照组100.179±0.009*●▲注：与空白组比较， *P<0.01; 与模型组比较， ●P<0.01; 与对照组比较， ▲P<0.01

　　3讨论

　　临床研究证实变应性鼻炎常合并咽炎、支气管哮喘[3];有实验证实，上下呼吸道炎症具有一致性，但内在机制尚不清楚。变应性鼻炎和哮喘的发病机理相似，都包括IgE介导的I型超敏反应[4]。Gaga等[5]发现哮喘患者鼻黏膜和支气管黏膜中嗜酸粒细胞的浸润程度密切相关，且与是否出现鼻部症状无关，表明上下呼吸道之间的联系除了表现为相关疾病症状的联系外，更重要地体现在潜在炎性反应的相关性方面。变应性疾病的病理学特征是局部组织中嗜酸性粒细胞的浸润，嗜酸性粒细胞被认为是变应性鼻炎发病中最关键的效应细胞[1]，因此，阻断嗜酸性粒细胞的趋化、募集、 浸润对于治疗变应性鼻炎具有重要意义。 1995年有学者从单核细胞、嗜酸粒细胞克隆出嗜酸细胞趋化因子受体3(CCChemokine receptor3， CCR3)，其cDNA长1.6 kb，开放读码框架编码355个氨基酸的蛋白质，CCR3基因位于染色体3p2124区[6] 。CCR3分布广泛，但主要表达于嗜酸粒细胞，也表达于TH2细胞及嗜碱粒细胞。其主要配体是Eotaxin、Eotaxin2、Eotaxin3，Eotaxin及其受体CCR3已被证实与AR发生发展密切相关。有学者研究发现CCR3最强的激动剂为Eotaxin[7]，CCR3是Eotaxin惟一受体。嗜酸粒细胞表面受体CCR 3与Eotaxin结合后，激活分裂素活化蛋白激酶(MAP)、细胞外信号调节激酶2(ERK2)和p38[8-9]，并在IL5和IL5受体等细胞因子参与下，促进骨髓CD34+祖细胞分化为成熟嗜酸粒细胞，并与细胞的迁移、趋化、原位激活、颗粒释放以及细胞快速形态变化产生各种生物学效应有关[10-11]。在CCR3基因敲除小鼠的研究显示，支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞计数明显减少，而且肺组织尤其是肺实质和局部淋巴组织中嗜酸性粒细胞浸润相对于对照组明显减轻，很好地体现了CCR3在哮喘气道嗜酸粒细胞聚集中所起的作用[12-13]。White等已合成数种CCR3的拮抗剂，并在研究中证实了CCR3阻断剂在治疗哮喘的可行性[14]。辛芷鼻敏胶囊系本课题组开发的中药新药，临床系统观察和相关实验研究表明，疗效确切可靠[15-16]。本研究结果显示：与空白组比较，AR模型组大鼠鼻黏膜和肺组织中CCR3mRNA表达显著增加，证实CCR3mRNA与变应性鼻炎有关，在AR大鼠肺组织中CCR3 mRNA的也有一定表达，证实变应性鼻炎发病时肺组织也有相应改变。本实验结果表明：辛芷鼻敏胶囊和鼻炎康均可下调鼻黏膜及肺组织中CCR3mRNA的表达，辛芷鼻敏胶囊对于鼻粘膜和肺组织CCR3mRNA的表达均有影响，差异有统计学意义(P<0.01)，说明实验组药物疗效优于对照组。辛芷鼻敏胶囊对上下呼吸道具有一定的作用，可能与全身机制有关，可能是通过影响CCR3mRNA的表达而阻止嗜酸性粒细胞等向气道组织快速迁移、活化，这可能是其治疗变应性鼻炎的重要途径之一。

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